제로 배경 플랫 끝 빠른 클론 키트 T4 원리 캐리어

제로 배경 플랫 끝 빠른 클론 키트 T4 원리 캐리어

ZERO-Blunt는제로 배경 플랫 끝 빠른 클론 키트

디렉토리 번호:42018

키트 구성, 저장, 안정성:

-20 ℃ 저장, 6개월 동안 사용 효과에 영향을 주지 않습니다.

구체적인 제품의 매개 변수는 제품 설명서를 받은 매개 변수를 기준으로 한다

v 제품 설명:

제로 배경 플랫 엔드 고속 연결 시약 카트리지는 플랫 엔드 PCR 산물과 플랫 엔드를 가진 모든 DNA 조각을 효율적으로 복제할 수 있는 우수한 자체 sha 유전자 양성 선택 복제 시스템이다.이 시약함은 인산화나 비인산화 DNA 조각에 모두 효과가 있다.양성선택 담체와 삽입세그먼트 련결은 5분이면 95% 가 넘는 양성재조합클론을 얻을수 있다.Pfu polymerase와 같이 보정 활성을 가진 중합 효소로 증폭된 평말단 PCR 산물은 복제 캐리어에 직접 연결할 수 있습니다.산물을 연결하면 자주 사용하는 대장균 균주를 직접 바꿀 수 있다.

시약함은 새로운 자가sha 유전자 양성 선택 복제 캐리어 pZERO-Blunt를 제공합니다.이 담체는 치사한 자사유전자 (다크론 비트 포함) 를 함유하고 있으며, 담체와 세그먼트의 연결이 성공하면 자사유전자가 정확하게 표현되지 않으며, 재조합자를 포함하는 세포는 정상적으로 성장할 수 있다;담체와 세그먼트의 연결이 성공하지 못할 때, 담체는 자체 연결 후 자체 sha 유전자가 정확하게 발현되고, 자체 연결 빈 담체를 포함하는 세포는 생존할 수 없다. 즉"제로 제로"배경이다.이러한 양성 필터링 전략은 청백색 반점 필터링이 필요 없어 클론 필터링 프로세스를 크게 가속화합니다.

효소 절단도와 세그먼트 유전자 삽입 조작을 편리하게 하기 위해 pZERO-Blunt 클론 캐리어의 다중 클론 비트 양쪽에는 각각 하나의 BglII 식별 서열이 포함되어 있다.이밖에 이 담체에는 T7 가동자가 함유되여있어 체내 또는 체외전사, 삽입세그먼트서렬분석 등 연구에 사용할수 있다.

작업 단계:

1. 연결 반응 준비:

평말단 PCR 산물이나 효소를 자른 후 평말단 조각은 글리세린 겔 전영 분리를 통해 회수할 수 있다 (장파 자외선 아래 접착제 또는 가시광선 투사 접착제를 사용하여 DNA 손상으로 인한 연결 실패를 피할 수 있다).운반체의 몰비와 비교하면 3: 1이다.당사가 생산한 DNA 산물 신속 순화 회수 시약함은 70bp 이상의 DNA 조각을 잘 회수할 수 있습니다.

2. 빠른 연결 반응:

1) 하나의 표준 10에서ml 접속 반응 체계에 1 추가mL 40, <NUM>pzero 둔한 Ch의 #1ml PCR 산물 (일반적인 상황에서 PCR 산물을 정밀하게 정량할 필요가 없다. 일반 PCR 산물과 캐리어의 몰비는 1: 1~10: 1로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 3: 1 추천, 부록 참조), 5ml 2´Quick ligation Buffer 및 0.9ml의 T4 DNA Ligase, 나머지는 멸균수로 보충한다.

반응은 다음 체계에 따라 진행됩니다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 22 ℃ 연결 5-10 분 (일반적으로 PCR 기기에서 수행 가능).

일반적으로 22 ℃ 연결 5-10 분, > 3kb 장편 연결은 30 분까지 연장 할 수 있습니다.30분을 초과하는 것을 추천하지 않으며, 초과하면 전환자 수를 낮출 수 있습니다.

3) 얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

3. 전환:

1) 100ml 감각적 세포, 얼음 위에 놓고 quan 해동 후 가볍게 몇 번 털어 세포를 균일하게 띄운다.

2) 가입 4-5ml 연결액(최대 모두 첨가할 수 있으며, 연결액의 부피가 감각적 세포 부피의 1/10을 초과하지 않는 한 가볍게 섞는다.얼음 위에 30분 동안 놓다.

3) 42 ℃ 의 수욕열은 90초 동안 격렬하다.얼음 위에 2~3분 정도 둔다.

4) 500 더하기ml LB 또는 SOC 배양기(항생제 불포함), 37℃ 150rpm 진동배양 60분.

5) 200을ml 세균을 암모니아벤질qing마이신에 도포(100mg/ml) 태블릿에 있습니다.

도포 세균의 사용량은 연결의 효율 및 감수성 세포의 감수성에 따라 적절히 조절되며, 복제가 적을 것으로 예상되면 원심(4000rpm, 2분) 후 배양액 일부를 흡입하고, 배양기 부유균체를 적당량 남긴 후 한 평판에 전부 또는 적당량을 도포할 수 있다 (도포 남은 균액은 4도에 보관할 수 있으며, 2일째 전환균이 떨어지면 한 개의 균을 모두 도포할 수 있다).

6) 평판은 37 ℃ 에서 1시간 동안 정방향으로 놓아 너무 많은 액체를 흡수한 다음 거꾸로 배양하여 밤을 지낸다.

5 필터링:

1). 일반 검사: 얻은 균락 접종 1-5 ml LB (종종 농도 100 함유mg/ml의 아미노벤젠 qing 마이신) 배양기, 37 ℃ 로터 진동 배양으로 밤을 새워 균종을 보존한 후 입자를 추출하고 PCR 또는 효소 절단 방법을 응용하여 삽입 세그먼트가 정확한지 감정한다.

2). 빠른 검사: 균락을 골라 직접 PCR 검사를 진행한다 (분자복제 제3버전 또는 당사 CV05-통용 T 담체 균락 PCR 감정 시약함 설명서 참조).
3). 시퀀싱 감정: 시약함 자체 유인물 또는 T7을 사용하여 하위 유인물 시퀀싱을 시작하여 의도 클론이 포함되어 있는지 확인합니다.

이 시약함에는 자체 시퀀싱 유인물 (균락 PCR 감식 유인물에도 사용):

v 부록:

ð 연결 반응에 필요한 PCR 결과물의 양은 어떻게 계산합니까?

일반 PCR 생산물 및 캐리어의 몰비는 1: 1~10: 1 (3: 1 권장) 으로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있으며 다음 공식을 사용할 수 있습니다.

[캐리어 추가량 (ng) × 삽입 세그먼트 크기 (kb) ÷ 캐리어 크기 (kb)] × 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비 = 삽입 세그먼트의 양 (ng) 예: 삽입 세그먼트와 캐리어 연결의 몰 비율은 3: 1이고, 연결 반응에 캐리어 40ng을 추가하면 삽입 세그먼트 크기는 500bp이며, 이때 삽입 세그먼트를 추가해야 하는 양은 [40ng × 72.9 kb] 이다.

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