One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제

노볼레드One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제

단계 원활한 클로닝 키트 (단편)

디렉토리 번호:42111

포장량:

제품 보관:-20°C 보관, 여러 번 얼지 않도록

구체적인 제품의 매개 변수는 제품 설명서를 받은 매개 변수를 기준으로 한다

제품 설명:단계별 원활한 클론 키트는T4는연결효소는 담체와 목적부분의 효소절위점의 제한을 받지 않고 직접 중첩부분으로 재조합하는 방법으로 특수한 효소조합을 채용하여 임의의 방법을 선형화한후의 담체와 그 량끝을 가질수 있다16-25bp중첩 영역의PCR는세그먼트 방향 재구성 연결,30분 이내에 구현A끝 또는 플랫 끝PCR는산물 세그먼트는 캐리어의 임의의 위치로 원활하게 클론됩니다.

제품 특징:

1. 30분마다 하나씩50bp-15kb PCR확장 세그먼트 (플랫/ A끝) 클론은 임의의 캐리어 위치에 삽입됩니다.

2.비수용체 및 삽입 세그먼트 효소 절위점의 가용성평화단/粘性末端的限복제, 아무 위치에서나 복제할 수 있습니다.

3. 원치 않는 염기 시퀀스를 삽입점에 도입하지 않는 원활한 클론

4. 연결 효소 및 인산 효소에 의존하지 않고 효율적이고 정확하며 복제 양성률이 높다95%이상.

원스텝 원활한 클론 키트 원리 설명도:

선형 캐리어 및 삽입DNA는세션 프로비저닝:

A: 선형 캐리어의 제조

(1).효소 절단 출처:효소 절단으로 얻은 선형 캐리어, 평말단 또는 점단, 단효소 절단 또는 쌍효소 절단은 모두 가능하며, 효소 절단 후 접착제는 회수한다.

참고: 한 단계 원활한 클론 반응 시스템 내 이중 체인 없음DNA는효소를 연결하면 캐리어 자체 연결 반응이 일어나지 않는다.따라서 단일 효소 절단 방식으로 제조된 선형화 캐리어도 말단 탈인산 처리를 할 필요가 없다.재조합 산물 전환 후 나타난 가짜 양성 복제(삽입된 세그먼트 없음)효소가 완전히 절단되지 않은 quan 미선형화 환상 캐리어의 전환으로 형성된 것이다.우리는 효소를 썰어 접착제를 회수하면 이런 미선형화담체의 비률을 가장 di정도로 낮출수 있다고 추천한다.

(2).역방향PCR는출처:고화질 사용 권장DNA는중합효소(상품번호:P517-05또는P812-05) 스트라이프 단일 확장 시 통과할 수 있는 제조PCR는산물 순화 (화물번호:DC012-50) 캐리어를 얻습니다. 그렇지 않으면 접착제를 통해 회수합니다 (화물번호:DC011-50)캐리어를 획득합니다.

참고: 대칭 이동PCR는의 입자 템플릿 역시 비선형 캐리어이며 삽입된 세그먼트가 없는 가짜 양성 클론으로 이어질 수 있습니다.PCR는원본 선형 캐리어 (PCR는산물) 순화 전용.Dpn I내접효소는 입자 템플릿을 소화하여 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.그러나 일반적인 상황에서 접착제를 회수하면 이미 이런 미선형화담체의 비률을 가장 di로 낮추기에 충분하므로 역방향PCR는출처의 선형화 캐리어도 접착제 회수를 추천합니다.

B: 삽입DNA는단편적 제조

(1).일차법 원활한 클론 유인물 설계의 전반적인 원칙은 유인물을 통해5’끝 선형 클론 캐리어 끝 동원 시퀀스 도입, 삽입 세그먼트 증폭 산물5’와3’맨 끝에 선형 클론 캐리어 양쪽 끝에 해당하는 완quan 일치 시퀀스가 있음(16 기본)～20 bp)。

(2).세그먼트 삽입 지시물 설계: 클론 지시물에는 세그먼트 삽입 특이성 지시물 시퀀스와 중첩 시퀀스가 포함됩니다.

정방향 유인물 복제(5’-3’): 선형 캐리어 양방향16-25 nt중첩 영역 시퀀스(3'끝은 계산하라')+삽입 세그먼트 양방향 특이 유인물 시퀀스 (18-25 nt）

클론 역방향 유인물(5’-3’): 선형 캐리어 역방향16-25 nt중첩 영역 시퀀스(3'끝은 계산하라')+삽입 세그먼트 역방향 특이 유인물 시퀀스 (18-25 nt）

참고: 중첩 영역의 최소 염기 기수16 bp및 다중 세그먼트 중첩 영역 간의Tm값은 정합성이 보장되어야 하며 >60°C (AT 두 = 2°C 및 GC 두 = 4°C)그렇지 않으면 알칼리 수치를 충족시킬 때까지 연장할 수 있습니다.

선형 캐리어 끝의 구조에 따라 (5'돌출,3'돌출, 평면 끝), 유인물 디자인도3다음과 같은 경우에 해당합니다.

선형화 캐리어의 양끝은 선형 방식(예를 들어 단효소 절단, 이중효소 절단, 역방향PCR는다름에 따라 위의 세 가지 말단 구조의 두 가지를 임의로 조합할 수 있으며 삽입 세그먼트 특이성 유인물 설계의 원칙은 일반 유인물 설계의 원칙을 따르면 된다.

증폭 유인물 퇴화 온도를 계산할 때 유전자 특이성 증폭 서열의Tm값, 캐리어 끝 동원 시퀀스는 계산에 참여할 수 없습니다.

(3).효소 선택: 고화질 사용 권장DNA는중합효소 또는PCR 혼합(품목 번호:P517-05또는P814-05）。

(4).반응 조건: 일반적으로 구체적으로 사용되는 중합효소 설명서에 따라 진행하면 된다.

(5).삽입 부분 순화

l 선택 사항: 조각이 재조합 캐리어와 동일한 저항성을 갖는 입자 템플릿에서 파생된 경우 순화 전에 사용Dpn I내접효소는 입자 템플릿을 소화하여 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.

l 세그먼트가 단일한 경우PCR는산물 순화 시약함 (화물번호:DC012-100) 세그먼트를 순화합니다.

l 비특이 증폭이 있을 경우 접착제로 시약함 (화물번호:DC011-100)조각을 회수하다.

l 이 방법을 사용하여 복제하면 선형화 담체에 사용되는 효소 절위점이 접합할 때 결핍될 수 있다. 만약 효소 절위점에 대해 엄격한 요구가 있다면 효소 절위점의 선택에 주의할 것을 건의한다. 필요할 경우정반향 복제 유인물의 중첩 구역 서열과 특이 유전자 서열 사이결핍된 알칼리기를 증가시켜 원래의 효소 절위점을 회복한다. (뒤의 예를 들어 설명하기 참조)

l 재조합 입자가 단백질 발현에 사용되는 경우 부팅 서브와 같은 필수 시퀀스 (예: 부팅 서브,RBS는시퀀스, 시작 암호 서브, 종료 암호 서브, 단백질 태그 등) 는 파괴되지 않습니다.

정방향 지시물 설계 예제 설명 (EcoR I는효소 절개):

위 그림과 같이 캐리어는Ecor I는효소 절개, 형성5'돌출 끝:

상술한 설계 원칙에 따라,3'끝은 계산을 시작하고 다시 계산한다16bp-25bp(이 예는 다음과 같습니다.20개의 bp끝은 동일한 시퀀스를 중첩합니다.) 의도 세그먼트의 특이 유인물 시퀀스 앞에 추가하면 됩니다.겹치는 영역의Tm값이 정합성을 유지하고 >60°C (AT 두 = 2°C 및 GC 두 = 4°C)。

양의 지시물은 다음과 같습니다.5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN3'

참고: 위의 지시물 설계에서 클론 연결을 완료하면EcoR I는효소 절위점은 사라질 것이다 (효소 절위점은 보존되지 않는다).

보존이 필요한 경우EcoR I는효소 절위점, 캐리어 끝에 있어야 한다20개의 bp중첩 시퀀스와 의도 세그먼트 특이 유인물 시퀀스 사이에 누락된EcoR I는비트 시퀀스 식별aattc는, 클론 접속이 완료되면EcoR I는효소 절위점은 여전히 존재한다.

구체적으로 다음과 같습니다.5' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN3'

역방향 지시물 설계 예제 설명 (Hind III는효소 절개):

위 그림과 같이 캐리어는Hind III는효소 절개, 형성5'돌출 끝:

상술한 설계 원칙에 따라,3'끝은 계산을 시작하고 다시 계산한다16bp-25bp(이 예는 다음과 같습니다.20개의 bp끝은 동일한 시퀀스를 중첩합니다.) 의도 세그먼트의 특이 유인물 시퀀스 앞에 추가하면 됩니다.겹치는 영역의Tm값이 정합성을 유지하고 >60°C (AT 두 = 2°C 및 GC 두 = 4°C)。

역방향 지시자는 다음과 같습니다.5'CTGCCATCGGATCGTGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

참고: 위의 지시물 설계에서 클론 연결을 완료하면Hind III는절위점은 사라집니다 (효소 절위점은 유지되지 않음).

보존이 필요한 경우Hind III는효소 절위점, 캐리어 끝에 있어야 한다20개의 bp중첩 시퀀스와 의도 세그먼트 특이 유인물 시퀀스 사이에 누락된Hind III는비트 시퀀스 식별agctt는，Hind III는효소 절위점은 여전히 존재한다.

구체적으로 다음과 같습니다.5' CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

원활한 클론 반응 단계:

참고:2 × OneStep 클론 혼합연결 강화제 포함PEG는매우 끈적끈적하다. 냉장고에서 꺼내면 온도가 낮을 때 더욱 끈적끈적하다. 손바닥에 놓고 몇 분 동안 얼려서 온도를 높이면 끈적끈적함을 낮출 수 있다. (품질에 영향을 주지 않는다.) 경탄이 고르게 섞여 순간적으로 원심을 떠나 관 밑으로 수집된다.

1. 다음 표에 따라 반응 체계 구축 (사용 가능PCR는실온에서 관리)

* 캐리어 일반용20-50 ng, 조각과 캐리어를 삽입한 몰비는2:1-3:1사이 최적;삽입 세그먼트가 작으면200bp, 조각과 캐리어의 몰비 삽입5:1。

2. 가볍게 섞다50°C반응15분 (지원 가능PCR는기기에서 진행), 반응이 끝나면PCR는튜브를 얼음에 설치한 후 직접 전환하거나 보존-20°C. 보다 짧은 세그먼트는 다음과 같습니다.100bp-1kb의단지15분만에 충분한 전환자를 얻을 수 있고, 비교적 긴 부분의 연결을 얻을 수 있으며, 반응 시간을 연장할 수 있다60분.

3. 取5μl반응산물은 감수상태세포설명서에 따라 전환된다 (전환자가 적으면 모든 산물을 전환시키고 모든 전환액을 도판할수 있다.).

양성 클론 인증:

구체적인 상황에 근거하여 균락을 선택할 수 있다PCR는감정, 입자 추출 (화물번호31013-100) 제한적인 내접효소 검정 또는 시퀀싱 검정을 실시한다.

One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제