pBLUE -T 캐리어 클론 키트 T4 원리 캐리어 및 기타

노볼레드pBLUE -T 캐리어 클론 키트 T4 원리 캐리어 및 기타

pBLUE -T 캐리어 클론 키트

카탈로그 번호: 42014

키트 구성, 저장, 안정성:

-20 ℃ 저장, 6개월 동안 사용 효과에 영향을 주지 않습니다.

구체적인 제품의 매개 변수는 제품 설명서를 받은 매개 변수를 기준으로 한다

제품 설명:

Taq DNA 중합 효소, Tth DNA 중합 효소와 같은 많은 고온 DNA 중합 효소 등 증폭 된 PCR 산물 3'-끝부분 뒤에는 모두 돌출된 염기A가 있는데 이런 PCR산물은 3'을 사용할수 있다.-끝 뒤에 돌출 염기 T가 있는 캐리어는 쉽게 복제할 수 있습니다.pBLUE-T 캐리어는 pBlueScript II SK(+) 입자에서 유래한 것으로, EcoRI 효소 절위점에 적절한 시퀀스를 첨가하여 XCM I 효소를 절개한 후 그 3'끝에서 직접 짝짓기 없는 T 염기를 생성하기 때문에 더욱 높은 재조합 효율을 얻을 수 있다.pBLUE-T 캐리어 삽입 비트 양단 독립te가 설계한 두 개의 ECOR I 비트는 삽입 세그먼트를 저렴하고 효율적인 ECOR I 단일 효소로 감지할 수 있도록 한다;또한 pBLUE-T 캐리어는 NdeI 또는 NcoI 제한성 내접효소 비트를 함유하지 않아 상기 효소 비트를 함유한 유전자를 복제하는 데 편리하게 사용할 수 있다.또한 당사의 캐리어 연결 체계는 배경이 낮고 (블루 반점이 10% 미만), 재구성률이 높으며 (화이트 반점 중 90% 이상이 삽입된 부분이 있음), 빠른 연결이 가능한 등의 특징이 있습니다.이 설명서 말미에는 pBLUE-T 캐리어와 관련된 기술 자료가 나열되어 있는데, 그 전체 시퀀스는 pBlueScript II SK(+) 시퀀스를 참조할 수 있지만, 그 다중 클론 효소 절위점의 시퀀스는 약간 다르다.

시퀀싱은 T3, T7 부트 서브 리더 및 M13 일반 시퀀싱 리더를 사용할 수 있습니다(다음 그림 참조).

작업 단계:

1. 연결 반응 준비:

PCR 산물의 순화 여부는 증폭 산물의 질에 달려 있다.PCR 산물이 매우 깨끗하면 순화 없이 직접 연결 반응을 할 수 있다.그러나 입자를 템플릿으로 하는 PCR 결과물이라면 순화해야 하며, 템플릿 입자가 흰 반점을 형성할 수도 있다.PCR산물은 글리세린 겔 전영을 통해 분리할 수 있다.당사가 생산한 DNA 산물 신속 순화 회수 시약함 대 70bp 이상의 DNA 조각은 회수가 잘 된다.

Taq, Tth, AmpliTaq, KlenTaq DNA 중합효소가 증폭된 PCR 산물은 그 끝부분에 모두 돌출된 3'을 가지고 있다-A。 있음3’-A 끝의 PCR 결과물은 pBLUE-T 캐리어로 직접 클론 연결할 수 있습니다.있다 3'®5'외절효소가 활성화된 DNA 중합효소(하이파이신 효소)가 증폭된 PCR 산물은 평말단이다. 이런 평말단 PCR 산물을 복제하려면 우량행 3'-엔드 플러스 A 작업.

2. 일반 연결 반응:

1) 하나의 표준 10에서ml 접속 반응 체계에 1 추가ml3pblue-t의 0%캐리어,Xml PCR는결과물 (일반적인 상황에서는PCR는산물은 정밀정량을 진행하여 일반 PCR 산물과 담체의 몰비를 2: 1~10: 1로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있으며, 3: 1을 추천한다),1ml 10´결합 버퍼및 0.5-1ml(2.5 - 5 Weiss Units)의 T4 DNALigase，나머지는 물로 보충한다.반응은 다음 체계에 따라 진행됩니다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 16 ℃ 연결 하룻밤 (일반적으로 PCR 기기에서 완료 가능).

보통 16℃ 연결로 밤을 보내는 것을 추천한다 (10ml시스템 표준 연결 효소량 2.5Weiss 단위가능), 가장 많은 전환자를 얻을 수 있습니다.하지만 PEG Enhancer가 포함된 이 시스템은 몇 배의 연결 효율성을 제공합니다.，높은 연결 효소량의 경우(10ml시스템 권장 연결 효소량 5Weiss 단위) 16 ℃ 를 30분 동안 연결하면 일반 연구의 요구에 도달할 수 있다.

3)얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

3. 빠른 연결 반응:

1) 반응은 다음 체계에 따라 진행한다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 22 ℃ 연결 5-10 분 (일반적으로 PCR 기기에서 수행 가능).

2 ´Quick Ligation Buffer는 이미 최적화된 빠른 연결 성분을 모두 포함하고 있으며, 일반적으로 22 ℃ 로 10 분 동안 연결하는 것을 권장합니다.（10ml시스템 연결 효소량 5Weiss 단위, 긴 세션 연결을 30분까지 연장할 수 있음) 일반적으로 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.또한 이 시스템은 16 ℃ 에서 30 분 동안 연결 할 수 있습니다 (10ml시스템 연결 효소량 5Weiss Units)는 일반적인 연구의 요구 사항을 충족할 수 있습니다.

3)얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

4. 전환:

에서50-100ml 감각적 세포, 얼음 위에 놓고 quan 해동 후 가볍게 몇 번 털어 세포를 균일하게 띄운다.

ð가입 4-5ml연결액(최대 모두 넣을 수 있으며, 부피가 감각적 세포 부피의 1/10을 초과하지 않는 한 가볍게 섞는다.얼음 위 배치30분.42 ℃ 수욕열격90초.얼음 위 배치 23 분.

ð더하기 500ml LB 또는 SOC 배양기(항생제 불포함), 37℃ 150rpm진동배양 60분.

ð200을ml세균 도포는 미리 16을 사용합니다.ml 50mg/ml IPTG및 40ml 20 mg/ml X-gal 도포된 암모니아벤젠 qing 마이신 플랫.

도포 세균의 사용량은 연결의 효율 및 감수성 세포의 감수성에 따라 적절히 조절되며, 복제가 적을 것으로 예상되면 원심(4000rpm, 2분) 후 배양액 일부를 흡입하고, 배양기 부유균체를 적당량 남긴 후 한 평판에 전부 또는 적당량을 도포할 수 있다 (도포 남은 균액은 4도에 보관할 수 있으며, 2일째 전환균이 떨어지면 한 개의 균을 모두 도포할 수 있다).

ð평판은 37 ℃ 에서 1시간 동안 정방향으로 놓아 너무 많은 액체를 흡수한 다음 거꾸로 배양하여 밤을 지낸다.
5 필터링:

1).전환자의 청백색 필터:

외부 DNA 조각이 pBLUE-T에 삽입되면외부 소스로 인해 중간DNA의 핵산 서열 존재는 LacZ 유전자의 코드를 변경하여 그 산물에 영향을 미쳤다b-반유당 효소a-조각의 활성 때문에 재조합 클론은 X-gal/IPTG 태블릿에서 흰색으로 표시되며 재조합 클론이 파란색으로 표시되는 것이 아닙니다.가끔세션 삽입은 영향을 미치지 않습니다.lacZ 유전자 판독 상자, 또는 삽입 조각이 너무 작고, 이 경우 균락 (재조합 클론) 은 옅은 파란색을 나타내거나 균락 중심에서 옅은 파란색 반점, 외곽 흰색 (어안상 파란색 반점 fish eye) 을 나타낸다.IPTG/X-gal 태블릿에서 생장하는 흰색 균락 또는 연한 파란색 균락을 선택하여 이쑤시개로 아미노벤젠 qing 곰팡이가 함유된 액체 배양기를 골라 37 ℃ 로 밤을 새웠다.
2).전환자의 감정:

a.위에서 배양한 흰색 균락의 균액으로 입자를 추출하여 ECOR I 단효소로 자르거나 기타 적합한 효소로 자르고, 글리세린 겔 전영으로 조각의 크기를 검사하여 목적의 조각이 함유되어 있는지 확인한다.

b.백색 균락을 골라 PCR 검사를 직접 진행합니다 (분자 클론 3 버전 참조 또는 문의 가능).

c. T3 및 T7을 사용하여 하위 지시자 또는 다른 적합한 지시자 시퀀싱을 시작하여 의도 클론이 포함되어 있는지 확인합니다.

연결 반응에 필요한 PCR 결과물의 양은 어떻게 계산합니까?

일반 PCR 생산물 및 운반체의 몰비는 2: 1~10: 1 (3: 1 권장) 으로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있으며 다음 공식을 사용할 수 있습니다.

¹ 캐리어 추가량 (ng) × 삽입 세그먼트 크기 (kb) ÷ 캐리어 크기 (kb)] × 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비 = 삽입 세그먼트의 양 (ng) 예: 삽입 세그먼트와 캐리어 연결의 몰 비율은 3: 1이고, 연결 반응에 캐리어 40ng을 추가하면 삽입 세그먼트 크기는 1000bp이며, 이때 삽입 세그먼트를 추가해야 하는 양은 [40ng x 12k b] 이다.

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