분자 상호 실험: CUT & amp;TAG 표적 절단 및 라벨화

1. 기술 소개

CUT & TAG는 항체 유도에 기반한 표적 염색질 절단과 라벨화된 고감도 표관 게놈 분석 기술로, 이 기술은 전통적인 ChIP-seq의 저감도, 고배경 소음, 샘플 수요량이 많은 병목 현상을 극복하고 단세포 수준에서 그룹 단백질 수식, 전사 인자 결합 등 염색질 특징을 해석할 수 있어 표관 유전학 연구의 새로운방향。

2. 기술원리

CUT & TAG는 4단계 핵심 반응을 통해 정확한 염색질 분석을 실현합니다.

1.항체 표적 위치:특이성 1항 (예: H3K4me3 항체) 은 목표 염색질 영역과 결합하여 Protein A/G 2항은 Tn5 로터 효소 복합체 (서열 분석 커넥터 포함) 를 가지고 있다.

2. 표적 절단 및 라벨화:Tn5 로터 효소는 항체 안내하에 목표 염색질에 대해 DNA 이중 체인 절단과 이음매 연결을 진행하며, 절단 범위: 목표 비트 양쪽 각각 약 50-300bp이다.

3. DNA 조각 방출:프로테아제 K는 염색질의 교련을 소화하고 이음매가 있는 DNA 조각을 방출한다.

4. 문고 구축 및 시퀀싱:PCR 확장 대상 세션, Illumina 시퀀싱 라이브러리 구축, 시퀀싱 깊이: ~20 million reads/sample (ChIP-seq 대비 50% 감소).

3. 응용장면

CUT & TAG는 단세포 수준에서 종양의 미세한 환경에서 서로 다른 아군의 표면적인 유전적 차이를 밝혀냈다.

예:

1.3 음성 유방암: 단세포 CUT & TAG를 통해 FOXA1이 조절하는 슈퍼 증강자가 기저 아형에서 특이적으로 활성화되어 있다는 것을 발견했다. 이 증강자들은 EMT (상피-간질 전환) 핵심 유전자 (예: SNAI1) 의 발현을 구동하고 전이를 촉진한다.

2.급성 골수계 백혈병: 재발 환자의 골수 샘플을 추적하여 CD34 + 줄기세포 중 H3K4me1 수식의 동적 변화를 감정하였는데, 이러한 변화는 화학 요법 내성의 발생을 예시하여 표관 표적 치료에 새로운 표적을 제공하였다.

3.배아 발육 표관 재프로그래밍: CUT & TAG는 초기 배아 발육 중 그룹 단백질 수식의 동적 구축 과정을 추적할 수 있다.

4.생쥐 착상 전 배아: H3K9me3이 2-cell 단계에서 퇴적하기 시작하는 것을 발견하고, LINE-1과 같은 역전록 전좌자 영역 (예: LINE-1) 을 우선적으로 표시하며, 이 수식은 전좌자 활성을 억제하여 게놈 안정성을 유지한다.

5.인간 배아 줄기 세포: 신경 분화에서 H3K27ac의 동적 지도를 그리고, SOX2와 OCT4가 조절하는 증강자 네트워크를 위치시키고, 다능성이 핵심 노드에서 퇴출되는 것을 밝혀낸다.

6.면역세포 기능 조절: T세포의 분화와 기능 상태를 분석하는 표면적인 기초.

7.T 세포 고갈: 만성 바이러스 감염 모델에서 고갈성 CD8 + T 세포를 발견한 H3K27ac는 PD-1과 TIM-3 유전자 자리에 비정상적으로 풍부하며, 이러한 증강자 활성은 TOX 전사 인자에 의해 직접 조절된다.

8.조절성 T세포 (Treg): 연합 ATAC-seq는 FOXP3가 EZH2가 전도하는 H3K27me3의 협동 억제에 의존하는 H3K4me3 수식을 재창조하여 Treg 세포의 억제성 기능을 안정시킨다는 것을 밝혀냈다.

4. 기술우세

1.높은 감도 (100 세포 레벨 검사): Tn5 로터 효소는 목표 위치에서 직접 절단하고 시퀀싱 커넥터를 연결하여 ChIP-seq에서 DNA 단편화 (초음파 파쇄) 로 인한 무작위 손실을 피합니다.ChIP-seq에 비해 CUT&TAG의 노이즈 비율은 8배(S/N=12:1 vs 1.5:1), 검출된 차이점 피크 수는 40% 증가했다.

2.단일 염기 해상도 및 정확한 위치: 항체 -Tn5 복합체는 결합 위치 근처의 DNA (± 50 bp) 만 절단하고 ChIP-seq의 초음파 파쇄는 200-500 bp 무작위 조각을 생성합니다.p53 결합 비트 분석에서 CUT&TAG는 단일 협착 피크 (피크 너비 약 30bp) 를 감지한 반면 ChIP-seq는 광폭 피크 (피크 너비 약 200bp) 를 보여 TTGCCT 기본 중심까지 정확하게 배치할 수 있다.

3.단세포와 공간 표관조학 호환성: 10x Genomics 플랫폼과 연합하여 마이크로 흐름 제어를 통해 단일 세포와 항체 -Tn5 복합체를 기름 방울에 감싸고, 이미 단세포 H3K27ac 도감 구축 (Nature Methods, 2022)을 실현했다.

4. 새로 개발된 Spatial CUT & Tag 기술은 조직 절편에 H3K4me3의 아구조 분포를 포지셔닝할 수 있다. 예를 들어 쥐 뇌 절편에서 해마구 뉴런 활성 관련 수식을 시각화할 수 있다.

5. 견본 유형

신선한 세포 (접벽세포/부유세포), 동존세포, 동존조직.

6. 견본 수요

세포 샘플: 약 100000개 (24 공판의 1 구멍이거나 부유 세포 형태로 원심관에 저장될 수 있음);

냉동 저장 조직: 약 10-20mg.

7. 견본 준비 & 운송

살아있는 세포 샘플: 거리가 가까운 것은 신선한 샘플을 제공할 수 있으며, 그릇/원심관 내에 배양된 신선한 세포 샘플을 상온 택배 (늦어도 다음날 도착) 운송할 수 있으며, 본 시내는 플래시 또는 직접 배달할 수 있다;거리가 비교적 먼 경우, -80 ℃ 의 동존세포 드라이아이스로 운송할 수 있다;

조직 샘플: -80 ℃ 냉동 드라이아이스 운송.

8. 공급해야 할 시약

ChIP급 항체(없을 때도 IF급 항체 선택 가능)

9. 실험주기

1~2주 (시퀀스 제외)

10. 기타

후속 테스트 Rrealtime PCR/시퀀스