바이러스 게놈 DNA/RNA 빠른 추출 키트

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PCR는기본 단계 및 고려 사항?

1. 실험원리

PCR는체외 인공 선택성 증폭이야DNA는의 한 가지 방법, 그것은 생물체 내와 유사하다DNA는을 (를) 복사합니다.생물체 내에서DNA는복제에는 템플릿, 유인물,DNA는중합효소,DNA는해선효소,dNTP; 그리고 몸 밖PCR는반응 역시 유사한 성분을 필요로 하는데, 템플릿, 유인물,PCR 버퍼、Taq는효소,dNTP.여기서 유인물은 특정 위치에 대한 증폭을 위해 인공적으로 설계된 특정 시퀀스입니다.PCR 버퍼반응하는 완충 환경 제공;반응과정은 생물체내와 마찬가지로DNA는이중 체인이 열리고 템플릿과 결합하여 새 체인으로 확장됩니다.그리고 이 과정들은 생물체 내에서DNA는해선효소는 체인을 분해하고 체외에서는 반응온도를 조절하여 실현된다.자주 사용하는 경우94℃변성 템플릿DNA는쌍사슬을 열고 퇴화온도에서 물건을 템플릿에 결합시키고 마지막으로72℃특정 세그먼트에 대해 확장을 완료하고 반복적으로 반복합니다.DNA는의 대량 증가.세 번째 순환이 시작되어야 과녁이 나온다DNA는구간이 같다DNA는분자, 한층 더 순환적으로 과녁을 산출한다DNA는구간의 지수가 배가되다.

증가 후기에,산물이 축적되다,지수 증폭을 보이던 반응을 평탄한 곡선으로 만들다,산물은 더 이상 순환수에 따라 뚜렷하게 상승하지 않는다,이를 플랫폼 효과라고 합니다.플랫폼 기간(고원)원래 잘못 배합하여 발생한 저농도 비특이성 산물을 계속 대량으로 증가시켜 비교적 높은 수준에 이르게 할 것이다.따라서 순환 횟수를 적절히 조절해 플랫폼 기간 전에 반응을 끝내고 비특이성 산물을 줄여야 한다.플랫폼 도착 기간(고원)필요한 반복 횟수는 샘플의 템플릿 복제본에 따라 달라집니다.

2. 주요 성분

1.템플릿은 여러 가지 형식이 될 수 있는데, 주로 게놈을 포함한다DNA는, 입자DNA는, 바이러스를 가진 게놈DNA는、PCR는결과물,cDNA는기다려야 하지만RNA는. 템플릿 유형에 따라 사전 변성의 시간과 양이 크게 다릅니다.일반적으로 큰 게놈의 경우DNA는예변성 시간10분충분하다DNA2min은, 바이러스를 가진 게놈DNA는예변성2분、PCR는산물 예변성2분됩니다.

주의cDNA는단일 체인DNA는하지만 여전히 할 수 있습니다PCR는의 템플릿은 첫 번째 루프에서 하나의 지시물만 결합하여 다른 체인을 작성합니다.두 번째 라운드부터 두 유인물은 모두 특이한 위치와 결합하여 일반과 실현되었다PCR는의 접속.단일 체인인RNA는진행할 수 없다PCR는증가의 원인은 바로 실현에 있다PCR는반응은DNA는중합 효소, 일부러 식별할 수 있을 뿐DNA는체인

2.템플릿의 양에 대해 말하자면, 보통25ul체계DNA는의 품질은 다음과 같습니다.50100ng. 게놈의 경우DNA는그 구조가 비교적 복잡하기 때문에, 추출의 농도도 왕왕 비교적 크므로, 농도가 너무 큰 쌍을 방지하기 위해서이다PCR는영향을 끼쳤기 때문에 추출한DNA는경도 희석을 하다.그렇지 않으면 농도가 너무 높으면 비특이성 증폭을 일으킬 수 있다.입자 및PCR는산물은 구조가 간단하고 추출 농도가 일반적으로 낮기 때문에 희석할 필요가 없다.

PCR는실험에서 주의해야 할 문제는 무엇이 있는가?

없다CT는값

검사 결과 없음Ct는값 상황,다음 문제 해결:

1, 순환 수 부족(보통 넘지 않는다45순환,배경값뿐만 아니라,정량도 정확하지 않다);

2、PCR는프로그램 설정 오류,형광 신호를 검출하는 절차가 잘못되었다.일반SG는법채택72℃확장 시 채집TaqMan의법칙은 일반적으로 퇴화가 끝날 때나 연장될 때 신호를 채집한다,또한 형광 채집 선택 여부;

3, 유인물 또는 프로브 분해.통과 가능페이지전기 수영은 유인물과 탐침의 분해 여부를 측정한다.;

4, 템플릿 양 분해 또는 이전 스플라인 부족(초과 없음500ng,시약함 설명서에 근거하면 된다),미지의 농도의 샘플은 계열 희석 샘플의 최고 농도부터 시작해야 한다;템플릿 분해가 발생한 경우,샘플 준비 중 불순물의 도입 및 반복적인 동결 상황을 고려해야 한다,템플릿 샘플을 소량으로 나누어 비축하는 것을 건의합니다,반복되는 얼음 녹는 것을 피하다;

5, 유인물 탐지기가 적합한지 여부(특히 내포된 자를 뛰어넘는 유인물,게놈 증폭 보장DNA;상하류 유인물Tm값 초과4℃이상도 증폭에 영향을 줄 수 있다)。

CT는너무 늦다

상대 정량에서Ct값은 일반적으로1525사이가 좋아요.,절대 정량에 있다면,복제본이 적은 샘플, Ct값이 커집니다.,그런데 웬만하면 넘지 말아야 돼요.40순환,그렇지 않으면 정량이 정확하지 않다.

그래서,판단Ct는값이 너무 늦게 나타나는 것이 비정상인지 여부,구체적인 실험 설계와 목적에 따라 진행해야 한다.

1, 증가 효율이 낮다.유인물 사이 또는 유인물과 프로브의 비율이 맞지 않음,최적화 필요;유인물 또는 프로브 설계 불합리,재설계 필요;

2、PCR는절차가 적합하지 않다,삼보법 으로 바꾸어 반응 하다,또는 퇴화 최적화/확장 온도,퇴화 온도를 적당히 낮출 수 있다;퇴화/짧은 연장 시간(권장 시간 조건 하에서 연장 가능10s);

3、MgCl2는농도가 맞지 않다,마그네슘 이온 농도 등을 높이다.PCR는각종 반응 성분의 분해 또는 샘플의 부족;

4、PCR는산물이 너무 길다.PCR는생산물 설계 초과500bp;

5, 템플릿에 억제물이 있습니다.순도 높은 템플릿으로 진행PCR는템플릿을 테스트하거나 희석합니다.

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