상품 번호：B1013/4/5/6

스토리지 기준：-20 ℃ 로 저장하고, 그룹 A는 빛을 피하고, 반복적으로 얼지 않도록 해야 한다.

제품 그룹：

제품 소개

세포가 죽는 뚜렷한 특징 중 하나는 세포 염색체이다DNA의 분해, 이 분해는 매우 특이하고 규칙적이며, 생성되는 서로 다른 길이의 DNA 조각은 180bp-200bp의 정수 배이며, 글리세린 겔 전영에서 특이한 사다리 모양의 Ladder 도감으로 나타난다.이 시약함은 TUNEL법을 사용하여 말단 디옥시 뉴클레오티드 전이효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)를 적용하여 죽은 세포에서 DNA가 끊어진 3´-OH 말단 촉매에 YF를 섞는다®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP에 표시된 DNA는 형광현미경으로 직접 관찰하거나 류식세포계로 정량할수 있다.TUNEL법은 괴사 세포나 투사 및 약물 치료로 인한 DNA 사슬이 끊어진 세포가 아닌 죽은 세포를 선택적으로 검출 할 수 있습니다.태그의 dUTP(예:땅가오신dUTP,생우소-dUTP），직접 제자리 검사를 할 수 있는 것은 더욱 빠르고 직접적인 검사 수단이다.

이 시약함은 응용범위가 넓어 랭동이나 파라핀절편에서의 세포죽음상황을 검측하는데 사용할수 있으며 배양된 밀착세포 또는 부유세포의 죽음상황도 검측할수 있다.괴사 세포나 투사 및 약물 치료로 인한 것이 아니라 선택적으로 죽은 세포를 검사할 수 있다DNA 사슬이 끊어진 세포.이 시약함은 세포의 쇠망을 검사하는데 시간이 짧아 한걸음의 염색반응만 있으면 세탁후 검사할수 있다.

사용 방법

실험 재료 (자체 준비)

PBS 완충액(pH~7.4)

0.4% Triton X-100(PBS 구성)

0.1% Triton X-100(PBS 구성, 5mg/mLBSA 포함)

4%많은ju甲quan（PBS 구성)

면역 그룹화 펜

탈랍 용매 (파라핀 슬라이스 샘플)

파라핀 절편 처리 관련 시약

항형광 담금질 봉편제

ddH2O는

실험 설계

A.양성대조

DNaseI 처리는 양성 대조 적재 볼륨을 제조합니다.DNase I는 단일 또는 이중 체인 DNA를 소화하여 3'-OH 끝을 노출시켜 인위적으로 세포를 죽일 수 있습니다.매번 실험을 한 번 하면 된다.(이번 실험 조작과 시약함의 문제 유무를 검증하는 데 사용)

B.음성대조

없음 사용TdT Enzyme의 TUNEL Reaction Buffer는 TdT Enzyme 대신 ddH2O를 사용합니다.(주로 세포 자체의 쇠망, 조작과정 등 원인으로 인한 비특이성염색을 배제하고 촬영노출강도를 조절한다.)

C. 실험처리팀

실험팀은 설명서에 따라 정상적으로 조작했다.

D.실험대조군

실험팀은 설명서에 따라 정상적으로 조작했다.

실험 절차

1. 견본 준비:

（1) 밀착 세포 또는 세포 도료의 경우

a. PBS 1회 세척.

참고: 세포 도료의 세포가 제대로 붙지 않을 염려가 있다면 샘플을 건조하여 세포를 더 단단히 붙일 수 있습니다.

b. 고정: 적당량 4% 추가많은ju甲quan（PBS 조제), 4℃ 고정 30min.PBS 세척 2회.

c. 투과: 적당량의 0.4% TritonX-100(PBS 조제)을 넣고 실온은 20min 투과한다.PBS 세척 2회.

d. 단계 2.TUNEL 반응으로 이동합니다.

（2) 현탁 세포 또는 세포 현액의 경우

a. 세포 수집(3-5×10⁶개 세포),1000rpm 원심분리 5min, PBS 2회 세척.

b. 고정: 적당량 4% 추가많은ju甲quan（PBS 조제) 충분히 중현세포, 4 ℃ 고정 30 min.2000rpm 원심분리 5min, PBS 세척 2회.

c. 투과: 적당량의 0.4% TritonX-100(PBS 조제)을 넣고 실온은 20min 투과한다.2000rpm 원심분리 5min, PBS 세척 2회.

d. 단계 2.TUNEL 반응으로 이동합니다.

（3) 파라핀 조직 절편

a. 슬라이스 선반 위에 파라핀 슬라이스를 놓고 60 ℃ 오븐에서 60min 슬라이스를 굽습니다.

b. 탈랍 및 수화: 슬라이스 샘플을 디메틸벤젠 I(10min) 디메틸벤젠 II(10min) 100% 에탄올 I(5min) 100% 에탄올 II(5min) 95% 에탄올(5min) 90% 에탄올(5min) 80% 에탄올(5min) 70% 에탄올(5min) ddH2O에 차례로 넣고 5min을 2회 헹군다.

주: 디메틸벤젠은 독성이 있어 휘발하기 쉬우므로 통풍장에서 이 조작을 진행하십시오.

c. 여과지로 절편 샘플 주위의 액체를 빨아들이고, 면역 조화 펜으로 샘플의 윤곽을 잘 동그라미로 하여 하류가 투과되고 표시될 수 있도록 한다.

주: 후속 실험 작업 중 면역 조화 필획의 윤곽권이 파괴된 것을 발견하면 즉시 보충해야 한다.

d. 투과: 1: 50의 비율로 2mg/mL의 Proteinase K 용액을 PBS로 최종 농도 40 µg/mL로 희석하고, 각 샘플에 100 µL를 넣어 용액이 전체 샘플 영역을 덮고 37 ℃ 에서 30min 부화시킨다.

참고:Proteinase K는 세포막과 핵막을 투과할 수 있어 후속 단계의 염색 시약이 세포핵에 충분히 들어가 반응하도록 해 표시 효율을 높인다.부화시간이 너무 길면 조직절편이 후속세탁절차에서 반송파편에서 탈락할 위험이 증가되며 너무 짧으면 투과성처리가 불충분하여 표기효률에 영향을 줄수 있다.더 나은 결과를 얻기 위해 Proteinase K의 농도, 부화 시간, 온도는 다른 유형의 조직 샘플에 따라 최적화되어야합니다.

e. 슬라이스 샘플을 1 × PBS에 세 번 담가 5min씩 헹구고, 여과지로 여분의 액체를 빨아들여 처리한 샘플을 젖은 상자에 넣어 촉촉하게 유지한다.

참고: 이 단계는Proteinase K는 깨끗하게 세탁합니다. 그렇지 않으면 후속 표시 반응을 심각하게 방해할 수 있습니다.

f. 단계 2.TUNEL 반응으로 전환합니다.

（4) 얼음조직 절편

a. 고정: 냉동 슬라이스를 꺼내 실온으로 돌려준다.슬라이스 샘플을 4% 담그기많은ju甲quan（PBS 조제)에서 실온을 30min 고정한다.슬라이스 샘플을 1 × PBS에 담가 10min씩 세 번 헹군다.

참고: 포름알데히드 세척이 깨끗하지 않을 염려가 있다면 최종 염색 효과에 영향을 미칩니다.포름알데히드 고정 완료 후 적당량 첨가 가능2mg/mL달다an산세척10min，남아 있는 고정액을 중화시키고 PBS 세척을 한다.

b. 여과지로 절편 샘플 주위의 액체를 빨아들이고, 면역 조화 펜으로 샘플의 윤곽을 잘 동그라미로 하여 하류가 투과되고 표시될 수 있도록 한다.

주: 후속 실험 작업 중 면역 조화 필획의 윤곽권이 파괴된 것을 발견하면 즉시 보충해야 한다.

c. 투과: 1: 50의 비율로 2mg/mL의 Proteinase K 용액을 PBS로 최종 농도 40 µg/mL로 희석하고, 각 샘플에 100 µL를 넣어 용액이 전체 샘플 영역을 덮고 37 ℃ 에서 20min 부화시킨다.

참고:Proteinase K는 세포막과 핵막을 투과하여 후속 단계의 염색 시약을 만들 수 있다세포핵에 충분히 들어가 반응하여 표기 효율을 높이다.부화시간이 너무 길면 조직절편이 후속세탁절차에서 반송파편에서 탈락할 위험이 증가되며 너무 짧으면 투과성처리가 불충분하여 표기효률에 영향을 줄수 있다.더 나은 결과를 얻기 위해,Proteinase K의 농도, 부화 시간, 온도는 다양한 유형의 조직 샘플에 따라 최적화되어야합니다.Proteinase K의 농도와 부화 시간을 최적화해도 염색 효과를 개선할 수 없다면 샘플을 1% Triton X-100 (PBS 조제) 에 담가 실온에서 3~5min 침투를 촉진할 수 있습니다.이후 슬라이스 샘플을 1×PBS에 담가 5min씩 세 번 헹군다.

d. 슬라이스 샘플을 1 × PBS에 세 번 담가 5min씩 헹구고, 여과지로 여분의 액체를 빨아들여 처리한 샘플을 젖은 상자에 넣어 촉촉하게 유지한다.

참고: 이 단계는ProteinaseK는 깨끗하게 세탁합니다. 그렇지 않으면 후속 표시 반응을 심각하게 방해할 수 있습니다.

e. 단계 2.TUNEL 반응으로 이동합니다.

（5) 양성 처리(양성 대조만 이 단계, 기타 시료는 TUNEL 반응 단계를 직접 진행)

a. 10×DNase I Buffer를 1×DNase I Buffer로 1×DNase I Buffer로 1:10 비율로 희석하여 준비한다.

b. 처리된 샘플에 100 µL 1 × DNase I Buffer를 넣고 모든 샘플 영역을 덮으며 실온 균형은 5min입니다.

c. 1×DNase I Buffer로 1:100에 DNase I(2U/μL)를 최종 농도 20U/mL까지 희석한 작업액.

d. 버퍼를 버리고 100μL 농도 20U/mL의 DNaseI 작업액을 넣어 실온에서 15min 부화시킨다.

e. DNase I 작업액을 버리고 PBS를 2회 세척한다.

f. 단계 2.TUNEL 반응으로 전환합니다.

2. TUNEL 반응

（1) TUNEL 반응액 조제(즉시 조제)

（2) 밀착 세포, 세포 도포 또는 조직 절편의 경우

a. 각 샘플에 50 μL TUNEL 반응액을 첨가하여 반응액이 균일하게 샘플을 덮을 수 있도록 한다.37 ℃ 피광 부화에 적합한 시간 (세포 추천 염색 시간 15-30minh, 조직 염색 시간 추천 1h).

참고:50 μL TUNEL 반응액은 코팅, 슬라이스 또는 96 공판 (다른 다른 공판은 TUNEL 반응액의 부피를 적절하게 조정하고 세포를 덮으면 됩니다.) 에 적합합니다.검사 대상 시료가 도장, 절편 또는 24공판, 12공판 또는 6공판일 경우 증발방지막을 사용하거나 자봉봉지나 기타 적당한 재료를 사용하여 스스로 구멍보다 약간 작은 원형 비닐로 재단하여 TUNEL 반응액을 넣은 후 시료에 덮으면 TUNEL 반응액이 증발하는 것을 방지하고 TUNEL 반응액이 균일하게 시료를 덮을 수 있다.

b. TUNEL 반응액을 버리고 PBS를 2회 세척한 후 0.1% Triton X-100 (PBS 조제, 5mg/mLBSA 포함) 으로 5min씩 3회 세척하면 유리된 미반응 표시물을 비교적 깨끗하게 제거할 수 있다.

c. (선택 사항) 각 샘플은 적정 농도 5μg/mL의 DAPI 염색액을 첨가하여 실온에서 빛을 피한다부화5min。염색이 완료되면 DAPI 염색액을 버리고 PBS는 5min씩 2회 세척한다.

d. (선택 사항) 슬라이스 패키징: 각 샘플 방울에 20 μL 항형광 담금질 패키징(항형광담금질 봉편제는 일부 염료에 적용되지 않을 수 있습니다. 실험 전에 사전 실험 테스트 매칭성을 권장합니다.) 덮개를 덮고 핀셋의 둔한 끝으로 덮개를 가볍게 두드려 기포를 제거하여 봉편을

완전.

e. 여과지로 여분의 액체를 빨아들이고 샘플 영역에 100 μL PBS를 추가하여 샘플을 촉촉하게 유지합니다.즉시 형광 현미경 아래에서 관찰하다.

（3) 현탁 세포 또는 세포 현액의 경우

a. 각 샘플 튜브에 50 μ LTUNEL 반응액을 첨가하여 가볍게 중현세포, 37 ℃ 피광 부화15-30min。10min 간격으로 미량 이액기로 세포를 가볍게 중현한다.

b. 2000rpm 원심분리 5min, TUNEL 반응액을 버리고 0.1% Triton X-100으로（PBS는 5mg/mL BSA를 포함하여 2 회 5min씩 세척하여 유리된 반응하지 않는 표시물을 비교적 깨끗하게 제거할 수 있도록 조제합니다.

c. 각 샘플 튜브는 100 μL 농도 5 μg/mL의 DAPI 염색액을 첨가하고 실온 피광 부화 5min.

d. 400 μL PBS 중현세포를 첨가하여 즉시 유동식 세포계로 검사하거나 도포한 후형광 현미경으로 관찰하다.

주의사항

1.사용하기 전에 제품을 순식간에 튜브 밑으로 원심 분리한 후 후속 실험을 진행하십시오.

2. 염색 배경이 무겁거나 특이하지 않은 착색이 뚜렷할 경우 염색 시간을 적당히 줄일 수 있다.

3. 실험 시 음성 대조군과 양성 대조군을 늘리는 것을 권장한다.

4. 그룹A 사용 시 마스크, 장갑을 착용하고 피부에 닿으면 즉시 많은 물로 헹궈주세요.

5. 형광 염료는 모두 담금질 문제가 존재하므로 가능한 한 빛을 피하여 형광 담금질을 늦추십시오.

6.본 제품은 과학연구에 한하여 림상진단 또는 치료에 사용되여서는 안되며 식품이나 약품에 사용되여서는 안되며 일반주택에 보관해서는 안된다.

7. 당신의 안전과 건강을 위해 실험복을 입고 일회용 장갑을 끼고 조작하십시오.