CHIP Assay Kit(자기)

상품 번호：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

스토리지 기준：4ºC 저장

제품 설명

CHIP 검사 키트는 면역 침전을 통해 타겟 단백질과 결합된 염색질 조각을 침전시키고, 마지막으로 PCR 또는 Southern 등의 방법으로 침전된 염색질 조각을 검사하는 키트에 사용된다.일반적으로 특정 전사 인자나 그룹 단백질과 같은 게놈 DNA 결합 단백질이 예상되는 특정 게놈 DNA와 동일한 복합체에 서열되어 있는지 검사하는 데 사용됩니다.ChIP 검사를 통해 재체의 (In Vivo) 대상 단백질과 예상 게놈 DNA 조각이 같은 복합체에 있는지에 대한 결론을 얻을 수 있다.ChIP의 검사 결과는 이러한 결합이 세포 내에서 실제로 발생한다는 것을 분명히 설명할 수 있다.

본ChIP 검사 키트는 HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic beads를 CHIP 드롭다운의 구슬로 사용하여 적재량이 높고 결합력이 강하며 시간을 절약하고 효율적이라는 특징을 가지고 있다.키트는 human GAPDH의 해당 시퀀스 일부를 증폭하는 데 사용할 수 있는 미리 혼합된 대조 유인물(Control Primers)을 제공하며, 유인물 시퀀스는 5'-TACTAGCGTTTTACGGCG-3'입니다. 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

작업 단계 (참조용):

1. 샘플 초음파 처리 조건의 최적화:

1. 적당량의 예냉된 PBS와 100mM PMSF를 준비한다.SDS Lysis Buffer를 적절한 온욕으로 SDS를 충분히 녹이고 섞습니다.

2. 세포를 250px 세포배양접시에 배양하는데 세포배양액의 용량은 10ml이다. 발생목적 단백질과 게놈 DNA가 결합될 것으로 예상되는 시간에 세포배양액에 직접 적당량의 포름알데히드를 넣어 최종 농도 1%까지 가볍게 섞는다.그런 다음 37ºC에서 10 분 동안 부화하여 목적 단백질과 해당 게놈 DNA를 교련합니다.예: 250px 세포배양접시에 세포배양액 10ml를 넣은 경우 포름알데히드 270ul 37%를 넣어야 한다.가능한 한 고품질의 유효 사용 기한 내의 포름알데히드를 사용하도록 주의하십시오.세포도 150px 세포배양접시에 배양할 수 있으며 관련 용액의 용량은 비율에 따라 조정해야 한다.

3. 1.1ml Glycine Solution(10X)을 넣고 가볍게 섞는다.실온은 5분간 두세요.

4. 세포 시료가 있는 배양접시를 얼음욕 위에 놓는다.포름알데히드와 글리신이 함유된 배양액을 빨아들여 가능한 한 액체가 잔류하지 않도록 유지한다.

5. 실온은 5분간 두고 그 동안 미리 차가운 PBS로 100mM PMSF를 1mM로 희석한다. 즉 빙욕으로 미리 차가운 1mM PMSF를 함유한 PBS를 조제한다.PMSF 수성 용액은 반드시 신선하게 조제해야 하며, 수상 중의 반감기는 약 30min이다.

6. 5-10ml로 예냉된 PBS(1mM PMSF 포함)를 넣어 세포를 씻고 액체를 다 빨아들여 액체가 남아있지 않도록 한다.

7.5-10ml 예냉된 PBS(1mM PMSF 포함)를 추가하여 세포를 더 세척하고 액체를 다 흡수하여 가능한 한 액체가 남아있지 않도록 유지한다.

8. 예냉된 PBS(1mM PMSF 포함) 1ml를 넣고 세포스크래치로 세포를 긁어내 원심관에 수집한다.만약 세포가 총으로 불어도 되고 총으로 불어도 된다.세포를 계수하여 각 관당 약 100만 개의 세포로 나누어 담는다.

9.4ºC, 800-1000g 원심분리 1~2분, 세포를 충분히 침전시킨다.침전이 충분하지 않은 것을 발견하면 원심 분리 시간을 적당히 연장할 수 있다.상청을 다 빨아들여 액체의 잔류를 최대한 줄이다.

10. 1mM PMSF가 적당히 함유된 SDS Lysis Buffer를 조제한다.이전 단계의 100 만 세포 침전은 1 mM PMSF가 함유 된 SDS Lysis Buffer 0.2 ml로 다시 서스펜션됩니다.

11.얼음욕에서 10분 동안 부화하여 세포를 충분히 분해한다.

12.게놈 DNA를 잘라내기 위해 초음파 처리, DNA의 대부분을 200-1000bp 크기로 끊어 버리고, 대부분의 조각을 400-800bp로 제어할 수 있다면 더 좋습니다.초음파 과정 중 샘플이 빙욕 중에 낮은 온도를 유지하도록 주의하십시오.초음파 절단의 효과는 후속 교련 후 일반적인 DNA 글리세린 겔 전영으로 검사할 수 있다.초음파 처리의 조건은 보통 10초 간격으로 총 3-4회로 설정할 수 있으며, 출력이 50W일 경우 최대 출력의 30% 로 설정하고 2mm 초음파 헤드를 사용한다.

서로 다른 초음파 처리 기기의 설치가 같지 않다. 초음파 조건을 모색할 때 먼저 다른 조건을 고정시킬 수 있다. 먼저 매번 초음파가 얼마나 오랫동안 뚜렷한 발열을 초래하지 않는지 확인한 다음에 서로 다른 초음파 횟수를 모색할 수 있다.대부분의 게놈은 적절한 초음파를 찾을 때까지DNA는 200-1000bp 크기로 끊어졌다.매번 초음파 부피와 세포 사용량이 고정되어야 한다는 것을 주의해야 한다. 그렇지 않으면 상대적으로 비교적 고정된 초음파 조건을 사용하여 후속 실험에 사용할 수 없다.

주: 쌍 초음파 후 게놈DNA 크기를 검사할 때 글리세린 겔 점염법(곧 핵산 염료를 loading buffer에 첨가하는 방식)이나 접착법을 사용하면 전기 수영 시 SDS가 이런 염료와 결합하여 이상 밴드를 형성하기 때문에 밴드는 보통 500~1000bp 정도이기 때문에 초음파 후 게놈 DNA 크기 판단에 일정한 영향을 끼칠 수 있다.후염법으로 스트라이프 크기를 측정하는 것이 좋습니다. 이 방법을 사용하면 이상 스트라이프가 나타나지 않고 초음파 후 게놈 DNA 크기에 대한 판단에 영향을 주지 않으며 스트라이프 크기가 더 정확합니다.

13. 초음파 처리된 0.2ml의 샘플에 8ul 5M NaCl을 넣고 섞는다.65ºC는 단백질과 게놈 DNA 사이의 교착을 제거하기 위해 4 시간 동안 가열합니다.

14. 등체적을 가미한 Tris 밸런스벤젠벤，vortex는 심하게 섞인 후 4ºC, 12000g 정도에서 5분 동안 원심을 분리한다.상청을 다른 원심관으로 흡수하다.

15.등체적염소모조를 첨가하고 vortex를 격렬하게 혼합한후 4ºC, 12000g 좌우 원심5min.상청을 다른 원심관으로 흡수하다.

주：위의 14 단계와 15 단계의 페놀 클로로포름 추출은 DNA 순화 시약 상자를 사용하여 작동 할 수 있습니다.

16.페놀클로로포름 추출 또는 DNA 순화 시약 상자를 통해 얻은 액체를 소량 채취하고, 페놀클로로포름 추출 산물에 대해서는 5-10ul, DNA 순화 시약 상자 순화 산물에 대해서는 2-5ul, 글리세린 겔 전영을 진행하며, 초음파 처리가 게놈 DNA에 대한 절단 효과를 관찰할 수 있다.

2. 염색질 면역 침전:

1.샘플 초음파 처리 조건을 최적화 한 후, 검사 대기 샘플에 대해샘플 초음파 처리 조건의 최적화중1-11의 단계를 수행하고 단계를 참조합니다.12 초음파 처리.

2.초음파 처리된 샘플의 경우 4ºC, 12000-14000g 원심 5min.클리어 (약 0.2ml) 에서 2ml 원심관에 넣고 얼음욕에 넣는다.

3. 적당량의 1mM PMSF를 함유한 ChIP Dilution Buffer를 조제한다.1mM PMSF가 포함된 ChIP Dilution Buffer 1.8ml를 넣어 초음파 처리된 시료를 희석해 최종 부피를 2ml로 만든다.

4. 20ul 샘플을 추출하여 Input으로 후속 검사에 사용합니다.취하다20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-자기 구리추가PBS 또는 TBST 용액을 500ul까지 불어서 세척하고, 자력대에 놓고 이액기로 상청을 조심스럽게 씻어내고, 2-3회 반복 세척한다(비특이성 1을 더 잘 줄이기 위해 1-5% BSA 또는 탈지우유로 Beads를 1시간 미리 처리할 수도 있다).

5. 씻거나 닫은 것20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-자기 구리단계 추가3 나머지 시료 중 무세포 시료의 용액을 공백 대조로 사용하거나 beads 시료를 추가하지 않고 음성 대조로 사용하거나 무관한 항체를 음성 대조로 사용할 수 있다.4ºC에서 천천히 회전하거나 흔들어 30-60min로 혼합하여 목적단백질 또는 상응하는 복합물을 침전시킨다.

6. 위의 샘플이 함유된 원심관을 자력틀에 10s 올려놓는다. 상청을 매우 조심스럽게 제거하고 침전에 닿지 않도록 한다.이어 아래와 같은 용액으로 침전을 차례로 세척한다. 1회 세척액의 용량은 1ml로 4ºC에서 3~5min씩 천천히 돌리거나 흔들어 세척한 후 자력대에 10s 올린다. 상청액체를 조심해서 제거하고 침전에 닿지 않도록 한다.

(a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer 세탁 1회.

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer 1회 세탁.

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer 1회 세탁.

(d) TE버퍼 2회 세탁.

주：위의 모든 세탁 단계를 완료한 후 얻은 침전은 PCR 증폭 목적의 유전자 서열이나 Southern으로 목적의 유전자 서열을 검사하거나 Western 검사 등에 사용할 수 있습니다.

셋,PCR 증폭 목적 유전자 서열(예: ChIP 산물은 목적 유전자 서열을 검사하는 데 사용):

1. 신선한 배합 적당량 Elution buffer(1% SDS, 0.1M NaHCO3).

2. 단계 완료면역 침전 단계第7단계 후, 즉 모든 세탁 단계를 완료한 후, 추가250ul Elution buffer。Vortex를 골고루 섞고 실온에서 돌리거나 흔들어 3-5min을 계속 씻어낸다.

3.자력 선반에 놓고 10초 동안 분리하여 상청을 새로운 원심관으로 옮깁니다.침전에 250ul Elution buffer를 추가합니다.Vortex를 골고루 섞고 실온에서 돌리거나 흔들어 3-5min을 계속 씻어낸다.

4.자력틀에 놓고 10초간 분리하여 상청을 제거한다.이전 단계, 즉 단계 3에서 얻은 업스트림과 결합합니다.모두 약 500ul 상청이다.

5. 500ul 상청에 20ul 5M NaCl을 넣고 섞는다.65ºC는 단백질과 게놈 DNA 사이의 교착을 제거하기 위해 4 시간 동안 가열합니다.2D 단계에서 얻은 Input의 20ul 샘플의 경우 1ul 5M NaCl, 혼합, 65º C를 넣고 4 시간 동안 가열하면 단백질과 게놈 DNA 사이의 교착을 제거하는 데 사용됩니다.이 단계가 완료되면 후속 단계를 진행하거나 -20ºC 동결 보관 후 다음 날 후속 단계를 계속할 수 있습니다.

주1: 현재 샘플은 이미 사용 가능PCR，1, 2, 5 또는 10ul 샘플을 PCR 검사 목적의 유전자에 템플릿으로 사용할 수 있습니다.이때 PCR의 효과는 침전될 수 있는 DNA의 양과 전체 PCR 증폭 체계가 목적 유전자를 쉽게 증폭시킬 수 있는지와 관련이 있다.PCR 효과가 좋지 않은 것으로 드러나면 후속 순화 절차를 거쳐 시료를 순화하고 농축한 뒤 PCR 검사를 하는 방안을 검토할 수 있다.

주2: 일반적으로 후속 순화 후 권장PCR 테스트, Input은 일반적으로 후속 순화 단계를 수행할 필요가 없습니다.

6. 약 520ul 시료에 10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris pH 6.5 및 1ul 20mg/ml 프로테아제 K를 첨가한다. 혼합 후 45ºC에서 60분간 부화한다.

7. 등체적 Tris 밸런스 추가벤젠벤，vortex는 심하게 섞인 후 4ºC, 12000g 정도에서 5분 동안 원심을 분리한다.상청을 다른 원심관으로 흡수하다.

8. 등체적염소모조를 첨가하고 vortex를 격렬하게 혼합한후 4ºC, 12000g 좌우로 5분간 원심분리한다.상청을 다른 원심관으로 흡수하다.

9. 20ug glycogen 또는 yeast tRNA를 넣고 1/10 부피의 3M NaAc, pH5.2를 넣고 2.5배 부피의 무수 에탄올을 넣는다.혼합 후 -70ºC 침전은 1시간 이상이거나 -20ºC 침전은 8시간 이상이어야 한다.

10.4ºC, 12000-14000g 원심분리 10분, 대부분의 상청을 조심스럽게 빨아들이고 침전을 건드리지 말아야 한다.

11. 에탄올 70% 약 1ml를 넣어 세척 침전.4ºC, 12000-14000g 원심분리 10min, 대부분의 상청을 조심스럽게 빨아들이고 침전에 접촉하지 마십시오.

12.4ºC, 12000-14000g 원심분리 1min, 잔류액체 조심해서 흡입하세요.

13.소량의 TE 또는 물로 DNA를 침전시켜 목적유전자의 PCR 검사에 사용한다.PCR에 사용되는 유인물은 Input을 템플릿으로 사용하여 해당 PCR 조건을 미리 탐색하고 최종 PCR 검사에 사용할 효과가 좋은 유인물 세트를 선택하여 2 그룹을 설계하는 것이 좋습니다.소수의 경우 PCR 밴드가 너무 약할 때 nested PCR 기술을 사용하여 두 차례 증폭할 수 있다.

주: 단계7단계부터 13단계까지 적절한 DNA 순화 시약함으로 DNA를 순화할 수도 있다.

넷째,Western에서 ChIP 결과물을 검사합니다(Western 테스트에 ChIP 결과물을 사용하는 경우).

1. 다음 단계염색질 면역 침전第8단계, 모든 세탁 단계를 마친 후 25ul SDS-PAGE 단백질 샘플 완충액(1X)을 첨가한다.SDS-PAGE 단백질 상부 완충액(1X)은 SDS-PAGE 단백질 상부 완충액(5X)을 물에 희석해 조제할 수 있다.끓는 물에 10분간 끓여라.

2. 10-20ul을 취하여 Western 테스트에 사용한다.

참고 사항:

1. ChIP에 대한 자체 저항, 37% 포름알데히드,PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)，프로테아제 K, Glycogen 또는 tRNA, Tris 균형벤젠벤, 클로로포름,95% 에탄올, 70% 에탄올, 3M NaAc (pH5.2) 및 자력 프레임, 세포 스크래치 또는 세포 삽.

2. 초음파 샘플 처리기 (sonicator) 를 자체 준비해야 하며, 초음파 분쇄기 또는 초음파 세포 분쇄기라고도 한다.

3. 포름알데히드를 사용할 때는 통풍장에서 조작하십시오.

4. 본 제품은 전문인원의 과학연구용에 한하여 림상진단 또는 치료에 사용되여서는 안되며 식품이나 약품에 사용되여서는 안되며 일반주택에 보관해서는 안된다.

6、당신의 안전과 건강을 위하여 실험복을 입고 일회용 장갑을 끼고 조작하십시오.