TRzol LS(액체 샘플 RNA 추출 시약)

상품 속성:

저장 조건:

TRzol LS는 실온에서 12개월간 안정적으로 보관할 수 있다.그럼에도 불구하고 최상의 결과를 얻기 위해서는 2-8 ° C의 환경에 보관하는 것이 좋습니다.

중요 팁:

독극물이 피부에 닿거나 삼키지 않으면 화상을 입을 수 있다.일단 피부에 닿으면 즉시 대량의 세제와 맑은 물로 세척한다.만약 불편함을 느낀다면 의사에게 진찰을 받고 기타 성분과의 정확한 치료방안을 모색해야 한다.

제품 설명:

TRzol LS 시약은 세포나 조직에서 총 RNA를 직접 추출하는 시약이다.그것은 세포를 분쇄하고 용해할 때 RNA의 완전성을 유지할 수 있다.염소모조를 첨가한후 원심을 분리하고 견본은 물견본층, 중간층과 유기층으로 나뉜다.RNA는 물 표본층에 존재합니다.위의 물 샘플층을 수집하면 RNA는 이소프로필알코올 침전을 통해 회수할 수 있다.사람, 동물, 식물, 세균을 막론하고 이 방법은 소량 및 대량의 조직과 세포에 모두 비교적 좋은 분리효과가 있다.TRzol LS 시약 조작상의 단순성 허용 동일

여러 샘플을 동시에 처리합니다.모든 작업은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.TRzol에서 추출한 총 RNA는 DNA와 단백질의 오염을 피할 수 있으며 RNA 자국 분석, 반점 교잡, poly(A) + 선별, 체외 번역, RNA 효소 보호 분석 및 분자 복제에 사용할 수 있습니다.PCR용 경우 두 개의 유인물이 단일 외현자 내에 있을 때 증폭 레벨의 DNase I로 추출된 총 RNA를 처리하는 것이 좋습니다.

참고 사항:

1. 소량의 조직(1~10mg)이나 세포(102-10 4개)에서 RNA 샘플을 분리한다: 조직이나 세포에 800µl TRzol을 넣는다.시료가 분해되면 염소모조를 첨가하고 2단계에서 추출작업을 진행한다.이소프로필알코올로 RNA를 침전시키기 전에 RNA 효소가 없는 glycogen을 5~10μg 첨가하여 물 표본층의 운반체로 삼는다.그 점도를 낮추기 위해 클로로포름을 넣기 전에 26번 주사기로 두 번 흡입하여 게놈 DNA를 절단한다.Glycogen은 물 표본 층에 남아 RNA와 함께 분석됩니다.4mg/ml로 농축되기 전에는 역전록 반응 제1사슬의 합성을 억제하지 않고 PCR도 억제하지 않는다.

2.균장화 후 및 클로로포름을 넣기 전에 샘플은 -60 ℃ 또는 -70 ℃ 에서 적어도 한 달 동안 보관 할 수 있습니다.RNA를 75% 에 침전시킨 에탄올은 2-8 ℃ 에서 최소 일주일, -5-20 ℃ 에서 최소 1년 동안 보관할 수 있다.

3. TRzol LS로 RNA를 추출할 때는 장갑과 안대를 착용한다.피부와 옷의 접촉을 피하다.화학 통풍장에서 조작을 마치다.호흡기 흡입을 피하다.예외가 없다면 실온은 15~30℃의 조건에서 유지된다.

자체 시약:

클로로포름, 이소프로필렌글리콜, 75% 에탄올(RNAse-Free water 조제), RNAse-Free water(RNA 효소가 없는 유리병에 물을 넣고 0.1%(V/V)까지 DEPC를 넣는다.밤을 새워 고압으로 멸균하다.0.5% SDS 용액(RNase-Free water 조제)(옵션).

작업 단계:

1. 시료 예처리 a. 생물 액체 0.25ml 당 액체 시료 (혈청, 혈장 등) 0.75ml TRzol LS를 첨가하고, 시료 중 세포의 분해를 돕기 위해 시료 첨가 총으로 액체 시료를 몇 번 분다.5~10×10 6개 세포당 최소 0.75ml TRzol LS를 첨가한다.전혈 샘플과 같은 고오염물 샘플을 함유한 경우, 멸균수로 1: 1 비율로 두 배로 희석한 후 추출을 시작할 수 있다.TRzol LS와 액체 시료의 최종 체적비는 항상 3: 1입니다.b. 조직은 glass 또는 강력한 균장기로 조직 샘플을 휘저어 50~100mg당 조직 또는 0.25ml당 조직 현액에 0.75ml의 TRzol LS를 더한다.일반적으로 50~100mg은 조직 부피가 0.25ml보다 작아야 하는데, 조직 시료의 부피가 0.25ml보다 작으면 멸균수를 넣어 조직 시료의 부피를 0.25ml로 조정하여 부피 비율이 3:1임을 보장한다.c. 단층으로 성장한 세포는 직경 3.5cm의 배양판에 직접 0.3ml-0.4ml의 TRzol LS 용해세포를 넣고 시료총으로 불어 세포를 충분히 분해하도록 돕는다.필요한 TRzol LS 양은 세포 수가 아닌 배양판의 면적에 따라 결정됩니다(10cm2당 0.3-0.4ml).분해물에 물을 넣을 필요가 없다. 배양판에 남아 있는 배양액이 TRzol LS를 충분히 희석했기 때문이다.d. 부유하게 성장하는 세포는 원심을 통해 세포를 침전한다.TRzol LS 시약에서 이액관으로 분해 세포를 반복적으로 분다.5 ~ 10 × 10 6의 동물 세포, 식물 또는 효모균 세포 또는 1 × 10 7 박테리아 당 0.75ml의 TRzol LS.단계 b와 마찬가지로 멸균수로 시료의 부피를 0.25ml로 조절한다. TRzol LS를 넣기 전에는 세포 세척을 피해야 한다. 그러면 mRNA 분해 가능성이 높아지기 때문이다.일부 효모균과 세균을 파열시키려면 균장기를 사용해야 할 수도 있다.2.분리단계에서 균장 시료를 15-30°C 조건에서 5min을 부화시켜 핵단백질을 분해시킨다.0.75ml TRzol LS당 0.2ml 클로로포름 첨가.시료관 뚜껑을 꼭 닫고 손으로 시험관을 15초 동안 힘껏 흔들어 실온에서 2~15min 부화시킨다.2~8°C에서 12000×g을 초과하지 않는 원심력으로 15min 고속으로 원심을 냉동한다.원심 분리 후 혼합물은 세 층으로 나뉜다. 하층-염소모조층, 중간층, 상층은 무색의 물샘플층이다.RNA는 예외 없이 물 표본층에 존재한다.물 샘플 레이어의 용량은 추가된 TRzol LS 용량의 약 70% 입니다.

2. RNA의 침전은 물 시료층을 깨끗한 시험관으로 옮기고, DNA와 단백질을 분리하려면 유기층과 중간층도 마찬가지로 보존해야 한다.물 표본층과 이소프로필알코올을 혼합하여 RNA를 침전시킨다.0.75ml 당 TRzol LS는 0.5ml 이소프로필렌글리콜을 대응합니다.혼합된 시료를 15-30°C 조건에서 10min 부화시키고 2~8°C에서 12000×g을 초과하지 않는 원심력으로 10min 고속으로 냉동한다.RNA 침전은 원심 분리 전에는 일반적으로 보이지 않으며, 원심 분리 후에는 시험관 벽과 관 바닥에 부착된 접착제 모양의 조각 침전이 형성됩니다.

3. RNA의 헹굼은 상층 현액을 제거한다.RNA 침전을 75%의 에탄올(RNase-Free water 배합)으로 한 번 씻고, TRzol LS 0.75ml당 최소 1ml의 75%를 더한다.소용돌이 진동 혼합 시료는 2~8 ° C에서 7500 × g을 초과하지 않는 원심력으로 5 min 고속으로 냉동됩니다.

4. RNA의 재용해실온은 RNA침전을 간단하게 건조하며 진공관에서 원심건조하지 말아야 한다.특히 RNA를 침전시켜 건조시키지 않는 것이 가용성을 크게 떨어뜨린다.부분적으로 용해된 RNA 샘플의 OD260/OD280 비율은 <1.6입니다.RNA를 이액관으로 몇 차례에 걸쳐 RNAse-Free water 또는 0.5% SDS 용액(RNAse-Free water 조제)을 옮겨 녹인다(RNA가 나중에 효소 절개 반응에 쓰일 경우 SDS 사용을 피한다.) RNA는 또한 100% 메틸 아미드 (이온 제거) 에 의해 다시 용해되어 -70 ° C에 보관됩니다.

PCR 기본 단계 및 고려 사항은?

1. 실험원리

PCR은 생체 내 DNA의 복제와 유사한 체외 인공 선택적으로 DNA를 증폭시키는 방법이다.생물체 내 DNA 복제에는 템플릿, 유인물, DNA 중합효소, DNA 해선효소, dNTPs가 필요하다;체외 PCR 반응 역시 템플릿, 유인물, PCR 버퍼, Taq 효소,dNTPs。그 중 유인물은 인공적으로 설계한 특정 서열로 특정 위치에 대한 증폭을 실현한다;PCR 버퍼는 반응하는 버퍼 환경을 제공합니다.반응과정은 생물체내와 마찬가지로 DNA쌍사슬이 열리고 유인물이 템플릿과 결합되여 연장되여 새로운 사슬을 형성한다.그리고 이러한 과정은 생물체 내에서 DNA 해선효소에 의해 사슬을 분해하고, 체외에서는 반응 온도를 통제함으로써 이루어진다.예를 들어 94 ℃ 변성 템플릿 DNA를 자주 사용하여 이중 체인을 열고, 퇴화 온도에서 템플릿에 물질을 결합하고, 마지막에 72 ℃ 에서 확장을 완료하고, 이 과정을 반복적으로 반복하면 특정 세그먼트 DNA에 대한 대량 증가를 실현할 수 있다.세 번째 순환이 시작될 때까지 표적 DNA 구간과 같은 DNA 분자가 생성되고, 표적 DNA 구간의 지수가 두 배로 더 순환한다.

증폭 후기에 산물의 축적으로 인해 원래 지수 증폭을 나타내던 반응이 평탄한 곡선으로 변하고 산물은 순환수에 따라 뚜렷하게 상승하지 않는다. 이를 플랫폼 효과라고 한다.플랫폼 기간 (Plateau) 은 원래 잘못 배합으로 인해 발생한 저농도 비특이성 산물을 계속 대량으로 증가시켜 높은 수준에 도달하게 한다.따라서 순환 횟수를 적절히 조절해 플랫폼 기간 전에 반응을 끝내고 비특이성 산물을 줄여야 한다.플랫폼 기간(Plateau)에 도달하는 데 필요한 순환 횟수는 샘플의 템플릿 복사본에 따라 달라집니다.

2. 주요 성분

1.템플릿은 여러 형태가 될 수 있습니다.주로 게놈 DNA, 입자 DNA, 바이러스를 가진 게놈 DNA, PCR 산물, cDNA 등을 포함하지만 RNA가 될 수 없습니다.서로 다른 유형의 템플릿의 경우 예변성의 시간과 템플릿의 양이 크게 다릅니다.일반적으로 큰 게놈 DNA의 예변성 시간은 10min으로 충분하며, 입자 DNA2min, 바이러스를 가진 게놈 DNA의 예변성 2min, PCR 산물의 예변성 2min이면 된다.

cDNA는 단일 체인 DNA이지만 PCR의 템플릿을 만들 수 있습니다. 다만 첫 번째 순환 시 하나의 유인물만 결합하여 다른 체인을 합성합니다.두 번째 라운드부터 두 유인물 모두 특이 비트와 결합하여 일반 PCR과의 연결을 실현했다.반면 같은 단일 체인인 RNA는 PCR 증폭을 할 수 없다. PCR 반응을 실현하는 것은 DNA 중합효소로 DNA 체인만 특별히 식별할 수 있기 때문이다.

2.모델의 양에 대해 말하자면, 일반적으로 25ul 시스템 DNA의 질량은 50100ng이다. 게놈 DNA의 경우 구조가 비교적 복잡하기 때문에 추출한 농도도 비교적 큰 경우가 많다. 농도가 너무 커서 PCR에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 추출한 DNA를 사다리꼴로 희석해야 한다.그렇지 않으면 농도가 너무 높으면 비특이성 증폭을 일으킬 수 있다.입자 및 PCR 산물의 경우 구조가 간단하고 추출 농도가 일반적으로 낮기 때문에 희석할 필요가 없다.

PCR 실험에서 주의해야 할 문제는 무엇입니까?

ct 값 없음

테스트 결과에 Ct 값이 없으면 다음 문제가 있는지 확인합니다.

1. 순환수가 부족하다 (일반적으로 45순환을 초과하지 않으며 배경값이 높아질뿐만아니라 정량도 정확하지 않다).

2. PCR 프로그램 설정 오류, 형광 신호를 감지하는 단계 오류.일반적으로 SG법은 72 ℃ 연장을 채택할 때 채집하고, TaqMan 법칙은 일반적으로 퇴화가 끝날 때나 연장될 때 신호를 채집하며, 또한 형광 채집이 선택되었는지 여부;

3. 유인물 또는 탐침의 분해.PAGE 수영을 통해 유인물과 탐침의 분해 여부를 검사할 수 있습니다.

4. 템플릿의 양이 분해될 수 있거나 샘플의 양이 부족할 수 있다 (500ng을 초과하지 않으며, 시약함 설명서에 근거하면 된다), 미지의 농도의 샘플에 대해서는 시리즈 희석 샘플의 최고 농도부터 시작해야 한다;만약 템플릿 분해가 발생하면 샘플 준비 중 불순물의 도입 및 반복적인 동결 상황을 고려해야 하며, 템플릿 샘플을 소량으로 나누어 비축하여 반복적인 동결을 피할 것을 건의한다;

5. 유인물 탐지기가 적합한지 (특히 유인물이 내포자를 뛰어넘어 게놈 DNA를 증폭시킬 수 있도록 한다;상하류 유인물 Tm 수치가 4 ℃ 이상을 초과하는 것도 증폭에 영향을 미친다).

ct 값 너무 늦음

상대 정량에서 Ct 값은 일반적으로 1525 사이로 제어하는 것이 좋습니다. 절대 정량에서 낮은 복사 수의 샘플에 대해 Ct 값은 커지지만 일반적으로 40 루프를 초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 정량이 정확하지 않습니다.

따라서 Ct 값이 너무 늦게 나타나는 것이 비정상적인 상황인지 판단하려면 구체적인 실험 설계와 목적에 따라 진행해야 한다.

1. 증폭 효율이 낮다.유인물 사이 또는 유인물과 탐침의 비율이 적합하지 않아 최적화해야 한다;유인물이나 프로브 설계가 불합리하여 재설계가 필요하다;

2. PCR 프로그램이 적합하지 않아 3단계로 반응하거나 퇴화/연장 온도를 최적화하여 퇴화 온도를 적당히 낮출 수 있다;짧은 퇴화/연장 시간 (권장 시간 조건에서 10s 연장 가능);

3. MgCl2 농도가 적합하지 않고 마그네슘 이온 농도 등을 증가시킨다.PCR 각종 반응 성분의 분해 또는 가검량의 부족;

4. PCR 산물이 너무 길다.PCR 생산물은 500bp 이상 설계되었습니다.

5. 템플릿에 억제물이 존재한다.순도 높은 템플릿으로 PCR 테스트를 수행하거나 템플릿을 희석합니다.

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