pBLUE-T Simple 캐리어 빠른 클론 키트 T4 원리

pBLUE-T 간단한캐리어 빠른 클론 시약함

pBLUE-T Simple 캐리어 빠른 클론 키트 T4 원리

디렉토리 번호:42119

키트 구성, 저장, 안정성:

-20 ℃ 저장, 6개월 동안 사용 효과에 영향을 주지 않습니다.

제품 설명:

pBLUE-T Simple Vector는 PCR 결과물(TA Cloning)을 효율적으로 복제하기 위한 전용 캐리어입니다.이 캐리어는 pBlueScript II SK(+) 입자를 개조한 것으로, 기존 T 캐리어 ECOR V를 절개한 후 T를 가하는 방법과 달리 pSURE-T Simple은 pBlueScript II SK(+)를 개조하여 기존 pBlueScript II SK(+) 다중 클론 비트에 Xcm I 효소를 도입하여 절개조한 후 기존 다중클론 비트 양쪽의'3'T를 직접적으로 재조합하지 않아 T의 효율이 높지 않다.동시에 pBlueScript II SK(+) 캐리어에 있는 다중 클론 효소 절위점을 제거하여 PCR 증폭 유인물에 적합한 효소 절위점을 도입해야 한다.이때 PCR 증폭 유인물로 가져온 효소 절위점을 사용하여 DNA 효소 절개를 할 때 효소 절개 반응은 T 캐리어의 다른 다중 클론 효소 절위점의 제한 효소의 영향을 받지 않아 효소 절개 효율을 크게 높이고 아크론성 출력을 증가시킬 수 있다.또한 당사의 캐리어 연결 체계는 배경이 낮고 (블루 반점이 10% 미만), 재구성률이 높으며 (화이트 반점 중 90% 이상이 삽입된 부분이 있음), 빠른 연결이 가능한 등의 특징이 있습니다.이 설명서 말미에는 pBLUE-T Simple 캐리어와 관련된 기술 자료가 나열되어 있는데, 그 전체 시퀀스는 pBlueScript II SK(+) 시퀀스를 참조할 수 있지만, 그 다중 클론 효소 절위점의 시퀀스는 약간 다르다.

시퀀싱은 M13 일반 시퀀싱 및 T3 부팅 하위 시퀀싱을 권장합니다 (다음 그림 참조)
작업 단계:
1. 연결 반응 준비

PCR 산물의 순화 여부는 증폭 산물의 질에 달려 있다.PCR 산물이 매우 깨끗하면 순화 없이 직접 연결 반응을 할 수 있다.그러나 입자를 템플릿으로 하는 PCR 결과물이라면 순화해야 하며, 템플릿 입자가 흰 반점을 형성할 수도 있다.PCR 산물은 글리세린 겔 전영을 통해 분리할 수 있다.당사가 생산한 DNA 산물 신속 순화 회수 시약함은 70bp 이상의 DNA 조각을 잘 회수할 수 있습니다.

Taq, Tth, AmpliTaq, KlenTaq DNA 중합효소가 증폭된 PCR 산물은 그 끝부분에 모두 돌출된 3'을 가지고 있다-A. 3'있음-A 끝의 PCR 결과물은 pBLUE-T Simple 캐리어로 직접 클론 연결할 수 있습니다.있다 3'®5'외절효소가 활성화된 DNA 중합효소(하이파이신 효소)가 증폭된 PCR 산물은 평말단이다. 이런 평말단 PCR 산물을 복제하려면 먼저 3'을 해야 한다.-엔드 플러스 A 작업.

2. 일반 연결 반응:

1) 하나의 표준 10에서ml 접속 반응 체계에 1 추가mL 30% 의 pblue-t 쉬움ml PCR 산물 (일반적인 상황에서 PCR 산물을 정밀하게 정량할 필요가 없다. 일반 PCR 산물과 캐리어의 몰비는 2: 1~10: 1로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 3: 1을 추천한다), 1ml 10´ligation Buffer 및 0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)의 T4 DNA Ligase, 나머지는 물로 보충합니다.반응은 다음 체계에 따라 진행됩니다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 16 ℃ 로 밤을 새운다 (일반적으로 PCR 기기에서 완성할 수 있다).

보통 16℃ 연결로 밤을 보내는 것을 추천한다 (10ml 시스템 표준 연결 효소 양은 2.5 Weiss Units이면 됩니다.) 가장 많은 전환자를 얻을 수 있습니다.그러나 이 시스템은 PEG Enhancer를 함유하고 있어 연결 효율을 몇 배 높일 수 있으며, 높은 연결 효소량의 경우(10ml 시스템 추천 연결 효소 양은 5 Weiss Units) 16 ℃ 연결 30 분이면 일반 연구의 요구 사항에 도달 할 수 있습니다.

3) 얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

3. 빠른 연결 반응:

1) 반응은 다음 체계에 따라 진행됩니다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 22 ℃ 연결 5-10 분 (일반적으로 PCR 기기에서 수행 가능).

2 ´Quick Ligation Buffer는 이미 최적화된 빠른 연결 성분을 모두 포함하고 있으며 일반적으로 22 ℃ 연결 10 분 (10ml 시스템 연결 효소 양은 5 Weiss Units이며 긴 조각 연결은 30 분까지 연장 될 수 있습니다.) 일반적으로 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다.또한 이 시스템은 16 ℃ 에서 30 분 동안 연결 할 수 있습니다 (10ml 시스템 연결 효소 양은 5 Weiss Units) 일반 연구의 요구 사항에 도달 할 수 있습니다.

3) 얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

4. 전환:

에서 50-100ml 감각적 세포, 얼음 위에 놓고, wan이 완전히 해동된 후 가볍게 몇 번 털어 세포를 균일하게 띄운다.

에서 가입 4-5ml 연결액(최대 모두 첨가할 수 있으며, 부피가 감각적 세포 부피의 1/10을 초과하지 않는 한 가볍게 섞는다.얼음 위에 30분 동안 놓다.42 ℃ 의 수욕열은 90초 동안 격렬하다.얼음 위에 2~3분 정도 둔다.

에서 500 더하기ml LB 또는 SOC 배양기(항생제 불포함), 37℃ 150rpm 진동배양 60분.

에서 200을ml 세균 도포는 미리 16ml 50mg/ml IPTG 및 40ml 20 mg/ml X-gal 도포된 암모니아벤젠 페니실린 su 평판.

도포 세균의 사용량은 연결의 효율 및 감수성 세포의 감수성에 따라 적절히 조절되며, 복제가 적을 것으로 예상되면 원심(4000rpm, 2분) 후 배양액 일부를 흡입하고, 배양기 부유균체를 적당량 남긴 후 한 평판에 전부 또는 적당량 도포할 수 있다 (도포 남은 균액은 4도에 보관할 수 있으며, 다음날 전환균이 적게 떨어지면 한 평판에 모두 도포할 수 있다).

에서 평판은 37 ℃ 에서 1시간 동안 정방향으로 놓아 너무 많은 액체를 흡수한 다음 거꾸로 배양하여 밤을 지낸다.

5 필터링:

1). 전환자의 청백색 필터링:

외부 DNA 조각이 pBLUE-T Simple에 삽입되면 외부 DNA의 핵산 서열 존재로 인해 LacZ 유전자의 인코딩이 변경되어 그 산물에 영향을 미칩니다.b-반유당 효소a-조각의 활성 때문에 재조합 클론은 X-gal/IPTG 태블릿에서 흰색으로 표시되며 재조합 클론이 파란색으로 표시되는 것이 아닙니다.어떤 때는 삽입 세그먼트가 lacZ 유전자 판독 상자에 영향을 주지 않거나 삽입 세그먼트가 너무 작다. 이런 경우 균락 (재조합 클론) 은 옅은 파란색을 나타내거나 균락 중심에 옅은 파란색 반점, 외곽 흰색 (어안상 파란색 반점 fish eye) 을 나타낸다.IPTG/X-gal 태블릿에서 자라는 흰색 균락 또는 연한 파란색 균락을 선택하여 이쑤시개로 아미노벤젠 페니실린이 함유된 액체 배양기를 골라 37 ℃ 로 밤을 새운다.

2). 전환자의 감정:

a. 상술한 배양한 흰색 균락의 균액으로 입자를 추출하고, 삽입부분에 있는 효소 절위점 효소로 자르고, 글리세린 겔 전영으로 단편의 크기를 검사하여 목적의 단편이 함유되어 있는지 확인한다.

b. 백색 균락을 골라 직접 PCR 검사를 진행하다

c. T3를 사용하여 하위 지시자 또는 M13 일반 시퀀싱 지시자 시퀀싱을 시작하여 의도 클론이 포함되어 있는지 확인합니다.

에서 연결 반응에 필요한 PCR 결과물의 양은 어떻게 계산합니까?

일반 PCR 생산물 및 운반체의 몰비는 2: 1~10: 1 (3: 1 권장) 으로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있으며 다음 공식을 사용할 수 있습니다.

¹ 캐리어 추가량 (ng) × 삽입 세그먼트 크기 (kb) ÷ 캐리어 크기 (kb)] × 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비 = 삽입 세그먼트의 양 (ng) 예: 삽입 세그먼트와 캐리어 연결의 몰 비율은 3: 1이고, 연결 반응에 캐리어 40ng을 추가하면 삽입 세그먼트 크기는 1000bp이며, 이때 삽입 세그먼트를 추가해야 하는 양은 [40ng x 12kb] 입니다.

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