One Step Gibson Cloning Kit 원활한 클론

1 단계 Gibson 클로닝 키트

(1-5개 세션 연결 가능)

One Step Gibson Cloning Kit 원활한 클론

디렉토리 번호:42112

포장량:

제품 보관:-20°C반복적으로 얼지 않도록 보존

제품 설명: 본 제품은T4는연결효소는 담체와 목적부분의 효소절위점의 제한을 받지 않고 직접 중첩부분으로 재조합하는 방법으로 특수한 효소조합을 채용하여 임의의 방법을 선형화한후의 담체와 그 량끝을 가질수 있다15-25bp중첩 영역의PCR는세그먼트 (플랫) 방향 재구성, 빠른 구현 가능1-5개별 세그먼트의 효율적이고 원활한 클론 복제

제품 특징:

1. 30분은 하나 이상의 길이, 짧은PCR는확장 세그먼트 (플랫) 삽입 캐리어.

2. 비수용체 및 삽입 세그먼트 효소 절위점의 가용성 및 캐리어 평단/점성 끝의 제한으로 임의의 위치에서 복제할 수 있습니다.

3.원치 않는 염기 시퀀스를 삽입점에 도입하지 않는 원활한 클론

4.효율성, 정확성, 양성률 >95%。

선형 캐리어 및 삽입 DNA 조각의 제조:

A: 선형 캐리어의 제조

(1).효소 절단 출처:효소 절단으로 얻은 선형 캐리어, 평말단 또는 점단, 단효소 절단 또는 쌍효소 절단은 모두 가능하며, 효소 절단 후 접착제는 회수한다.

참고: 원활한 결합 및 복제 반응 시스템 내에는 이중 체인 DNA 연결 효소가 없으며 캐리어 자체 연결 반응이 발생하지 않습니다.따라서 단일 효소 절단 방식으로 제조된 선형화 캐리어도 말단 탈인산 처리를 할 필요가 없다.재조합 산물 전환 후 나타나는 가짜 양성 복제 (삽입 부분 없음) 는 효소 절불환 전미선형 환상 캐리어 전환으로 형성된다.우리는 효소를 절단한 후 접착제를 회수하면 이런 미선형화 캐리어 비율을 zui 낮은 정도로 낮출 수 있다고 추천한다.

(2).역방향 PCR 출처:고화질 DNA 중합효소 (화물번호: P517-05) 를 사용하여 제조하는 것을 권장하며, 만약 증폭 밴드가 단일하면 PCR 산물 순화 (화물번호: DC012-100) 를 통해 운반체를 얻을 수 있고, 그렇지 않으면 접착제 회수 (화물번호: DC011-100) 를 통해 운반체를 얻을 수 있다.

주: 역방향 PCR의 입자 템플릿도 비선형화 캐리어이며, 가짜 양성 클론 (삽입 부분 없음) 을 초래할 수도 있기 때문에 PCR 출처 선형 캐리어 (PCR 산물) 순화 전에 Dpn I 내접효소로 입자 템플릿을 소화하면 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.그러나 일반적으로 접착제 회수를 거치면 이러한 미선형화 캐리어 비율을 zui 낮음으로 낮추기에 충분하기 때문에 역방향 PCR 출처의 선형화 캐리어도 접착제 회수를 추천한다.

B: DNA 조각을 삽입하는 제조

(1).단일 삽입 조각 클론 유인물 설계: 클론 유인물에는 삽입 조각 특이성 유인물 시퀀스와 중첩 시퀀스가 포함됩니다.

클론 양방향 지시자(5'-3'): 선형 캐리어 양방향 16-25 nt 중첩 영역 시퀀스(3'끝에서 계산) + 삽입 세그먼트 양방향 특이 지시자 시퀀스(18-25 nt)

클론 역방향 유인물 (5'-3'): 선형 캐리어 역방향 16-25 nt 중첩 영역 시퀀스 (3'끝에서 계산) + 삽입 세그먼트 역방향 특이 유인물 시퀀스 (18-25 nt)

참고:중첩 영역의 염기 기수는 최소 16bp이며, 다중 중첩 영역 사이의 Tm 값은 60°C(AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)로 일관성을 유지해야 하며, 그렇지 않으면 요구 사항을 충족할 때까지 염기 수를 연장할 수 있습니다.

선형 캐리어 말단의 구조(5'돌출, 3'돌출, 평말단)에 따라 유인물 설계도 3가지 상황으로 나뉜다.

선형화담체의 량끝은 선형방식 (예를 들면 단효소절단, 이중효소절단, 역방향 PCR) 에 따라 상기 세가지 말단구조의 두개가 임의로 조합될수 있으며 삽입세그먼트의 특이성유인물설계의 원칙은 일반유인물설계의 원칙을 준수하면 된다.

증폭 유인물 퇴화 온도를 계산할 때는 유전자 특이성 증폭 서열의 Tm 값만 계산하면 되며, 운반체 말단 동원 서열은 계산에 참여해서는 안 된다.

상술한 설계 원칙에 따라 3'단부터 계산하여 16bp-25bp (이 예는 20bp 말단이 같은 서열을 중첩하는 것을 사용했다) 로 되돌아가 목적 세그먼트의 특이 유인물 서열 앞에 추가하면 된다.중첩 영역의 Tm 값이 > 60 ° C(AT pair = 2 ° C and GC pair = 4 ° C)에서 일관되게 유지되도록 합니다.

양방향 유인물은 구체적으로 다음과 같다: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN 3'

참고: 위의 유인물 설계가 클론 연결을 완료하면 EcoR I 효소 절위점이 사라집니다 (효소 절위점은 유지되지 않음).

보존이 필요한 경우 EcoR I 효소 접점, 캐리어 말단 20bp 중첩 시퀀스와 의도 세그먼트 특이 유인물 시퀀스 사이에 누락된 EcoR I 식별 비트 시퀀스 aattc를 보완해야 합니다.클론 연결이 완료된 후에도 EcoR I 효소 접점은 여전히 존재합니다 (효소 접점 유지).

구체적으로 다음과 같다: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

운반체는 Hind III 효소에 의해 절개되어 5'돌출 말단을 형성한다:

상술한 설계 원칙에 따라 3'단부터 계산하여 16bp-25bp (이 예는 20bp 말단이 같은 서열을 중첩하는 것을 사용했다) 로 되돌아가 목적 세그먼트의 특이 유인물 서열 앞에 추가하면 된다.중첩 영역의 Tm 값이 > 60 ° C(AT pair = 2 ° C and GC pair = 4 ° C)에서 일관되게 유지되도록 합니다.

역방향 지시자는 다음과 같습니다. 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

참고: 위의 유인물 설계가 클론 연결을 완료하면 Hind III 절위점이 사라집니다 (효소 절위점은 유지되지 않음).

보존이 필요한 경우 Hind III 효소 접점, 캐리어 끝 20 bp 중첩 시퀀스와 의도 세그먼트 특이 유인물 시퀀스 사이에 누락된 Hind III 식별 비트 시퀀스 agctt를 보완해야합니다. ，Hind III 효소 접점은 여전히 존재합니다 (효소 접점 유지).

구체적으로 다음과 같다: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

(2).다중 삽입 세그먼트의 클론 유인물 설계: 캐리어 양쪽 끝과 연결된 삽입 세그먼트 유인물 설계 방법과 단일 세그먼트 설계 방법

* 여러 삽입 세그먼트 사이의 중첩 영역 설계에는 위의 * 태그 (파란색과 빨간색) 의 두 가지 방법이 있습니다. 다중 세그먼트 유인물 설계 시 임의의 방법 또는 두 가지 방법을 선택하여 혼용하면 세그먼트와 세그먼트 사이에 15-25bp의 중첩 영역이 보장됩니다.

(3).효소의 선택: 고화질 DNA 중합 효소 또는 PCR Mix (화물 번호: P517-05 또는 P814-05) 를 사용하는 것이 좋습니다.

(4).반응 조건: 일반적으로 구체적으로 사용되는 중합효소 설명서에 따라 진행하면 된다.

(5).삽입 부분 순화

l옵션:만약 세그먼트가 입자 템플릿에서 유래하고 이 입자가 재조합 캐리어와 같은 저항성을 가지고 있다면, 순화 전에 Dpn I 내접효소로 입자 템플릿을 소화하면 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.

l조각이 단일한 경우 PCR 생산물 순화 시약함 (화물번호: 43012-100) 으로 조각을 순화하는 것이 좋습니다.

l만약 비특이 증폭이 있다면, 접착제로 시약함 (화물번호: 43011-100) 을 회수하여 조각을 회수하는 것이 좋습니다.

l이 방법을 사용하여 복제하면 선형화 캐리어에 사용되는 효소 절위점이 조립할 때 결핍될 수 있습니다. 만약 효소 절위점에 대해 엄격한 요구가 있다면 권장합니다 효소 절위점의 선택에 주의하고, 필요할 때정반향 복제 유인물의 중첩 구역 서열과 특이 유전자 서열 사이결핍된 알칼리기를 증가시켜 원래의 효소 절위점을 회복한다. (앞에서 서술한 정반향 유인물 설계의 예를 들면 설명 참조)

l재조합 입자가 단백질 발현에 사용되는 경우, 유인물 설계 시 코드 판독, 단백질 발현 및 순화에 필요한 시퀀스 (예: 부팅 서브, RBS 시퀀스, 시작 암호 서브, 종료 암호 서브, 단백질 라벨 등) 가 파괴되지 않도록 주의하십시오.

원활한 클론 반응 단계:

참고: 2 × Cloning Master Mix는 연결 강화제 PEG가 들어 있어 끈적끈적하여 냉장고에서 꺼내면 온도가 낮을 때 더 끈적끈적합니다. 손바닥에 놓고 몇 분 동안 얼려 온도를 높이면 끈적끈적함을 낮출 수 있습니다 (품질에 영향을 주지 않음). 손가락bo 원심관 바닥을 충분히 섞거나 소용돌이 진동을 섞는다.

1. 다음 표에 따라 반응 체계 구축 (PCR 튜브를 사용하여 실온에서 조제할 수 있음)

* 캐리어는 일반적으로 10-50 ng을 사용하며 삽입 조각과 캐리어의 몰비는 2: 1-3: 1 사이에서 가장 좋습니다.삽입 세그먼트가 200bp 미만이면 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비가 5:1, 다중 세그먼트가 연결된 경우 세그먼트와 세그먼트 사이의 몰비가 1:1입니다.

2. 가볍게 섞어서 50에°C 반응 15분(PCR 기기에서 가능), 반응이 끝나면 PCR 튜브를 얼음에 설치한 후 직접 전환하거나 -20에 보관°C. 3개 세션이 넘는 연결로 반응 시간을 30분까지 연장할 수 있습니다.

3. 반응산물 5μl를 취하여 감수성 세포설명서에 따라 전환(전환자가 적으면 모든 산물을 전환시키고 모든 전환액을 도판할 수 있다).

양성 클론 인증:

구체적인 상황에 근거하여 균락PCR감정을 선택하고 질립자 (화물번호 31011-100) 를 추출하여 제한성내절효소감정 또는 서렬분석감정을 진행할수 있다.

One Step Gibson Cloning Kit 원활한 클론