제로 배경 플랫 끝 빠른 클론 키트 T4 원리

Zero-Blunt 간단한 빠른 결합 키트
pZERO-Blunt 간단한제로 배경 플랫 끝 빠른 연결 시약함
(MCS 없음)

제로 배경 플랫 끝 빠른 클론 키트 T4 원리

카탈로그 번호: 42113

키트 구성, 저장, 안정성:

-20 ℃ 저장, 6개월 동안 사용 효과에 영향을 주지 않습니다.

제품 설명:

제로배경평말단 쾌속련결시약함은 우수한 zi살유전자양성선택복제시스템으로서 평말단 PCR 산물과 평말단을 가진 그 어떤 DNA조각도 능률적으로 복제할수 있다.이 시약함은 인산화나 비인산화 DNA 조각에 모두 효과가 있다.양성선택 담체와 삽입세그먼트 련결은 5분이면 90% 가 넘는 양성재조합클론을 얻을수 있다.Pfu polymerase와 같이 보정 활성을 가진 중합 효소로 증폭된 평말단 PCR 산물은 복제 캐리어에 직접 연결할 수 있습니다.산물을 연결하면 자주 사용하는 대장균 균주를 직접 바꿀 수 있다.

시약함은 새로운 zi 살해 유전자 양성 선택 복제 캐리어 pZERO-Blunt Simple을 제공합니다.이 운반체는 치사한 zi살 유전자를 함유하고 있으며, 운반체와 세그먼트의 연결이 성공하면 zi살 유전자가 정확하게 표현되지 않으며, 재조합자를 포함하는 세포는 정상적으로 성장할 수 있다;담체와 세그먼트의 연결이 성공하지 못하면 담체가 자연적으로 련결된후 zi살유전자가 정확하게 표현되고 자연적으로 련결된 담체를 포함하는 세포가 생존할수 없다. 즉"제로ZERO"배경이다.이러한 양성 필터링 전략은 청백색 반점 필터링이 필요 없어 클론 필터링 프로세스를 크게 가속화합니다.

pZERO-Blunt Simple은 삽입 비트 근처의 다중 클론 효소 절위 지점을 제거하여 PCR 증폭 유인물에 적합한 효소 절위 지점을 가져와야합니다.이때 PCR 증폭 유인물로 가져온 효소 절위점을 사용하여 DNA 효소 절개를 할 때 효소 절개 반응은 T 캐리어의 다른 다중 클론 효소 절위점의 제한 효소의 영향을 받지 않아 효소 절개 효율을 크게 높이고 아크론성 출력을 증가시킬 수 있다.

작업 단계:

1. 연결 반응 준비：

평말단 PCR 산물이나 효소를 자른 후 평말단 조각은 글리세린 겔 전영 분리를 통해 회수할 수 있다 (장파 자외선 아래 접착제 또는 가시광선 투사 접착제를 사용하여 DNA 손상으로 인한 연결 실패를 피할 수 있다).운반체의 몰비와 비교하면 3: 1이다.당사가 생산한 DNA 산물 신속 순화 회수 시약함은 70bp 이상의 DNA 조각을 잘 회수할 수 있습니다.

2. 빠른 연결 반응:

1) 하나의 표준 10에서ml 접속 반응 체계에 1 추가mL 40, <NUM>pzero 둔성 단순 Ch의 #1ml PCR 산물 (일반적인 상황에서 PCR 산물을 정밀하게 정량할 필요가 없다. 일반 PCR 산물과 캐리어의 몰비는 1: 1~10: 1로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 3: 1 추천, 부록 참조), 5ml 2´Quick ligation Buffer 및 0.9ml의 T4 DNA Ligase, 나머지는 멸균수로 보충한다.

반응은 다음 체계에 따라 진행됩니다.

일반적으로 마지막으로 T4 DNA Ligase를 추가합니다.

2) 22 ℃ 연결 5-10 분 (일반적으로 PCR 기기에서 수행 가능).

일반적으로 22 ℃ 연결 5-10 분, > 3kb 장편 연결은 30 분까지 연장 할 수 있습니다.30분을 초과하는 것을 추천하지 않으며, 초과하면 전환자 수를 낮출 수 있습니다.

3) 얼음 위를 냉각한 후 -20 ℃ 로 전환하거나 저장한다.

3. 전환:

1) 100ml 감각적 세포, 얼음 위에 놓고, wan이 완전히 해동된 후 가볍게 몇 번 털어 세포를 균일하게 띄운다.

2) 가입 4-5ml 연결액(최대 모두 첨가할 수 있으며, 연결액의 부피가 감각적 세포 부피의 1/10을 초과하지 않는 한 가볍게 섞는다.얼음 위에 30분 동안 놓다.

3) 42 ℃ 의 수욕열은 90초 동안 격렬하다.얼음 위에 2~3분 정도 둔다.

4) 500 더하기ml LB 또는 SOC 배양기(항생제 불포함), 37℃ 150rpm 진동배양 60분.

5) 200을ml 세균을 암모니아벤젠 페니실린에 도포(100mg/ml) 태블릿에 있습니다.

도포 세균의 사용량은 연결의 효율 및 감수성 세포의 감수성에 따라 적절히 조절되며, 복제가 적을 것으로 예상되면 원심(4000rpm, 2분) 후 배양액 일부를 흡입하고, 배양기 부유균체를 적당량 남긴 후 한 평판에 전부 또는 적당량을 도포할 수 있다 (도포 남은 균액은 4도에 보관할 수 있으며, 2일째 전환균이 떨어지면 한 개의 균을 모두 도포할 수 있다).

6) 평판은 37 ℃ 에서 1시간 동안 정방향으로 놓아 너무 많은 액체를 흡수한 다음 거꾸로 배양하여 밤을 지낸다.

4. 필터링:

5. 일반 검사: 얻은 균락 접종 1-5 ml LB (종종 농도 100 함유mg/ml의 아미노벤젠 페니실린 su) 배양기, 37 ℃ 로터 진동 배양으로 밤을 새워 균종을 보존한 후 입자를 추출하고 PCR 또는 효소 절단 방법을 응용하여 삽입 세그먼트가 정확한지 감정한다.

6. 빠른 검사: 균락을 골라 직접 PCR 검사를 진행한다 (분자복제 제3버전 또는 당사 CV05-통용 T 담체 균락 PCR 감정 시약함 설명서 참조).

7. 시퀀싱 감정: 시약함 자체 유인물 또는 T7을 사용하여 하위 유인물 시퀀싱을 시작하여 의도 클론이 포함되어 있는지 확인합니다.

이 시약함에는 자체 시퀀싱 유인물 (균락 PCR 감식 유인물에도 사용):

부록:

에서 연결 반응에 필요한 PCR 결과물의 양은 어떻게 계산합니까?

일반 PCR 생산물 및 캐리어의 몰비는 1: 1~10: 1 (3: 1 권장) 으로 최적화하면 좋은 결과를 얻을 수 있으며 다음 공식을 사용할 수 있습니다.

[캐리어 추가량 (ng) × 삽입 세그먼트 크기 (kb) ÷ 캐리어 크기 (kb)] × 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비 = 삽입 세그먼트의 양 (ng) 예: 삽입 세그먼트와 캐리어 연결의 몰 비율은 3: 1이고, 연결 반응에 캐리어 40ng을 추가하면 삽입 세그먼트 크기는 500bp이며, 이때 삽입 세그먼트를 추가해야 하는 양은 [40ng × 72.9 kb] 이다.

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