다중 클론 항체 제조 서비스

다중 클론 항체 제조 서비스

다항 일반 제조 절차: * 항원의 준비 - + 토끼의 면역 - → 효가 검사 및 종방 - + 항체 친화 순화 - + 항체의 농축 및 보존.

구체적인 실험 절차는 다음과 같다.

1. 토끼의 준비

건강한 6주 크기의 뉴질랜드 흰토끼 두 마리 (약 2Kg) 를 골라 새로운 생활환경에 적응시키고 최소 며칠 동안 안정시킨 뒤 * 채혈, 예채혈 (음성 참조용) 을 한다

1.1 토끼를 조심스럽게 고정된 선반에 넣어 평온하게 한다.

1.2 토끼 귀의 털을 조심스럽게 깎아 혈관을 선명하게 합니다 (깎지 않을 수도 있습니다).

1.3 필요하다면 작은 솜덩이에 알코올을 묻혀 혈관 부위에 발라 혈관을 팽창시킨다.

1.4 주사기로 귀정맥에서 혈액 약 10ml(약 5ml 혈청)를 추출한다.

1.5 조심스럽게 바늘을 뽑아 상처에서 피가 나지 않도록 적당히 누른 후 알코올 솜덩이로 상처를 소독한다;

1.6 수집한 혈액을 37C에 놓고 30min 살린 후 4'C에 놓고 밤을 지내며 응결시켜 혈청을 방출한다.

1.7 응결된 혈액을 10000r/min 원심분리 10min;h. 상청을 모으면 혈청이다.

토끼의 면역

2.1 토끼 두 마리를 투여한 항원은 1ml이다. 항원 완충용액은 토끼에게 해로운 화학 시약을 함유하지 않아야 한다. 토끼 한 마리당 400ug 항원을 처음 면역하는 것이 적합하다. 적당히 줄여서 더 좋은 결과를 얻을 수도 있다. 후속 면역은 매번 100ug이면 된다.

2.2 1m의 불씨*조제와 준비된 1m의 항원을 충분히 혼합하여 유백색을 띤다. .

2.3 조심히 우리에서 토끼를 꺼내고 토끼를 짜서 4개 부위 (등과 허벅지 뿌리 모두 가능), 각 부위 250ul, 바늘은 45도 각도로 피하 1-2cm를 삽입하고 주사를 맞은 후 수초 동안 머물러 항원 유출을 방지한다.

2.4 토끼역주기는 20일이고 면역이 끝난후 7~10일 동안 피를 뽑는다 (중도테스트채혈과 종방혈 포함). 도합 4~5회 면역된다.

3. 효가 검사

3.12개의 참조음성참조는 예취혈혈청으로서 모두 1항시작농도로 희석 (페쇄희석액) 한다.양성 참조는 이전입니다.

양성 혈청

3.2 96공판에 구멍당 100ul, 1ug/m 항원을 넣고 49C에서 밤을 지내며 37°C에서 2시간 동안 부화할 수 있다.

3.3 항원 용액을 버리고 구멍당 200u의 폐쇄액을 넣고 49C로 밤을 보내거나 379C로 2시간 동안 부화한다.

3.4 폐쇄액을 붓고 흡수지에 두드려 잔류액체를 최대한 빨아들인다. 세척액 세척판으로 세 번 매번 잔류액체를 최대한 말린다. 일정 기간 두려면 37 ° C에서 말리고 봉주머니로 20 ° C에 봉하여 보관한다.

3.5 패킷 제거용 96 슬래시,第---구멍은 음성 참조액 100ul, 두 번째 구멍은 양성 참조액 100ul, 세 번째 구멍은 1: 500의 측정 대기 항혈청을 첨가하고, 후속 각 구멍은 이를 바탕으로 배율 희석하여 37 ° C에서 1시간 동안 부화한다.

3.6 액체를 붓고 세척액으로 판을 세 번 씻어 말린다.구멍당 100u의 HRP 마커를 넣은 생쥐는 토끼 lgG(1:2000 희석)에 저항하며 37°C에서 45분간 부화한다.

3.7 액체를 붓고 세척액으로 판을 세 번 씻어 말린다.구멍당 100u의 TMB 바탕물(Sigma 단조분 TMB)을 37°C에서 5-20분(색상의 깊이에 따라 발색 시간을 결정) 부화시킨다.

3.8 구멍당 50u의 종료액(2N H2SO4)을 넣고 효소표시기에서 파장 450nm의 흡광값을 읽는다.

항체 효능가 검사가 100만 이상 되면 토끼를 종방혈할 수 있다.

항체의 순화

4. 항체의 친화-친화기둥의 제조

4.1 CNBr-Sepherose 4B의 글리세린 겔 1mg을 2mmol/L의 염산에 넣고 4'C가 밤을 새워 충분히 녹이면 3m의 용해제를 얻을 수 있다.

4.2 젤을 순화 기둥에 옮겨 넣고 약 20ml 2mmol/L의 염산으로 매체를 3회 씻는다.

4.3 우연 완충액으로 매체를 씻는다-회, 활성화 기단은 우연 완충액 PH값에서 쉽게 수해되기 때문에 이 단계몇 분 안에 완료합니다.

4.4 5ml 우연완충액에 용해된 5-10mg의 항원을 젤에 첨가

4.5 실온에서 가볍게 혼합하여 2-4시간 흔들거나 4'C로 밤을 지새우며 결합효율을 측정해야 할 경우 이 절차가 끝난 후 소량의 용액을 취하여 측정을 기다린다.20ml의 우연 완충액으로 매질을 한 번 - 번 씻는다.

4.6 15m1 1% BSA 용액을 넣고 실온에서 2시간 또는 4'C를 부화시켜 밤을 보낸다.

4.7 인산염 완충액으로 매질을 3회 이상 세척하고 매번 15m 이상 h.

4.8 항원 고상화 완료, 순화에 사용 가능.

4.9 즉시 사용하거나 사용하지 않으면 에탄올 20% 로 봉인한다.

5. 항혈청의 순화와 보존

5.1 항혈청은 PBS 등 부피로 희석하고 5000-10000/min 원심분리 15분, 청을 취한다.

5.2 항원 친화 기둥을 10배 부피의 PBS로 세척하여 기둥의 균형을 맞춘다.

5.3 희석된 항혈청 10m를 균형 잡힌 기둥에 넣는다.

5.4 실온에서 가볍게 섞어 2-4시간 흔들거나 4'C로 하룻밤 보내기

5.5 10배 부피의 PBS로 항원기둥을 세척하여 기둥에 결합된 잡단백질을 씻는다

5.6 기둥을 2배 부피의 항체 세척액으로 세척하여 특이성 항체를 얻는다

5.7 10배 크기로 PBS 평형기둥

5.8 알코올 20%로 기둥을 봉하고 4'C는 보존한다.

씻은 항체를 얻은 후 사탕수수당이나 폴리에틸렌글리콜을 농축한 후 PBS에서 소금을 투석하여 자외선 가시 분광 광도계를 사용하여 파장 280nm에서 항체 OD값을 측정하고, 얻은 OD값을 1.35로 나누면 측정된 항체의 농도이며, 40~50% 글리세린을 첨가하여 20 ^C에 두면 장기간 보존할 수 있다.

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