One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제

단계 원활한 클로닝 키트 (단일 세션)

One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제

디렉토리 번호:42111

포장량:

제품 보관:-20°C 보관, 여러 번 얼지 않도록

제품 설명:1단계 무봉복제 시약함은 T4 연결효소에 의존하지 않고 캐리어와 목적 세그먼트의 효소 절위점의 제한을 받지 않으며 직접 중첩세그먼트 재조합 방법으로 특수한 효소 조합을 사용하여 임의의 방법을 선형화한 캐리어와 그 양끝의 16-25bp 중첩구역을 가진 PCR 세그먼트 정방향 재조합 연결을 통해 30분 이내에 A 말단 또는 평말단 PCR 산물 세그먼트의 고효율 무봉복제 캐리어에 무봉합을 실현할 수 있다.

제품 특징:

1. 30분에 50bp-15kb PCR 증폭 세그먼트(평/A 끝) 클론을 임의의 캐리어 위치에 삽입할 수 있습니다.

2. 캐리어 및 삽입 세그먼트 효소 절위점의 가용성과 평단/점성 말단의 제한을 받지 않고 임의의 위치에서 복제할 수 있다.

3. 원치 않는 염기 시퀀스를 삽입점에 도입하지 않는 원활한 클론

4. 연결 효소 및 인산 효소에 의존하지 않고 효율적이고 정확하며 복제 양성률은 95% 이상에 달한다.

원스텝 원활한 클론 키트 원리 설명도:

선형 캐리어 및 삽입 DNA 조각의 제조:

A: 선형 캐리어의 제조

(1).효소 절단 출처: 효소 절단으로 얻은 선형 캐리어, 평말단 또는 점단, 단효소 절단 또는 쌍효소 절단 모두 가능, 효소 절단 후 접착제 회수.

참고: 한 단계 무봉합 클론 반응 시스템 내에는 이중 체인 DNA 연결 효소가 없으며 캐리어 자체 연결 반응이 일어나지 않습니다.따라서 단일 효소 절단 방식으로 제조된 선형화 캐리어도 말단 탈인산 처리를 할 필요가 없다.재조합 산물 전환 후 나타나는 가짜 양성 복제 (삽입 부분 없음) 는 효소 절불wa 전미선형화 환상 캐리어 전환으로 형성된다.우리는 효소를 절단한 후 접착제를 회수하면 이런 미선형화 캐리어 비율을 zui 낮은 정도로 낮출 수 있다고 추천한다.

(2).역방향 PCR 출처: 고화질 DNA 중합효소를 사용하여 제조하는 것이 좋습니다. 만약 증폭 밴드가 단일하면 PCR 산물 순화 (화물번호: DC012-50) 를 통해 운반체를 얻을 수 있습니다. 그렇지 않으면 접착제 회수 (화물번호: DC011-50) 를 통해 운반체를 얻을 수 있습니다.

주: 역방향 PCR의 입자 템플릿도 비선형화 캐리어이며, 가짜 양성 클론 (삽입 부분 없음) 을 초래할 수도 있기 때문에 PCR 출처 선형 캐리어 (PCR 산물) 순화 전에 Dpn I 내접효소로 입자 템플릿을 소화하면 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.그러나 일반적으로 접착제 회수를 거치면 이러한 미선형화 캐리어 비율을 zui 낮음으로 낮추기에 충분하기 때문에 역방향 PCR 출처의 선형화 캐리어도 접착제 회수를 추천한다.

B: DNA 조각을 삽입하는 제조

(1).일차법 빈틈없는 클론 유인물 설계 총의 원칙은 유인물 5'단에 선형화 클론 캐리어 말단 동원 서열을 도입함으로써 삽입 세그먼트 증폭 산물 5'와 3'최말단에 각각 선형화 클론 캐리어 두 말단에 대응하는 wan이 모두 일치하는 서열 (16bp~20bp) 을 띠게 하는 것이다.

(2).세그먼트 삽입 지시물 설계: 클론 지시물에는 세그먼트 삽입 특이성 지시물 시퀀스와 중첩 시퀀스가 포함됩니다.

클론 양방향 지시자(5'-3'): 선형 캐리어 양방향 16-25 nt 중첩 영역 시퀀스(3'끝에서 계산) + 삽입 세그먼트 양방향 특이 지시자 시퀀스(18-25 nt)

클론 역방향 유인물 (5'-3'): 선형 캐리어 역방향 16-25 nt 중첩 영역 시퀀스 (3'끝에서 계산) + 삽입 세그먼트 역방향 특이 유인물 시퀀스 (18-25 nt)

참고: 중첩 영역의 염기 기수는 최소 16bp이며, 다중 중첩 영역 사이의 Tm 값은 60°C(AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)로 일관성 있게 유지되어야 하며, 그렇지 않으면 요구 사항을 충족할 때까지 염기 수를 연장할 수 있습니다.

선형 캐리어 끝의 구조 (5'돌출, 3'돌출, 평면 끝) 에 따라 유인물 설계도 다음과 같은 세 가지 상황으로 나뉜다.

선형화담체의 량끝은 선형방식 (예를 들면 단효소절단, 이중효소절단, 역방향 PCR) 에 따라 상기 세가지 말단구조의 두개가 임의로 조합될수 있으며 삽입세그먼트의 특이성유인물설계의 원칙은 일반유인물설계의 원칙을 준수하면 된다.

증폭 유인물 퇴화 온도를 계산할 때는 유전자 특이성 증폭 서열의 Tm 값만 계산하면 되며, 운반체 말단 동원 서열은 계산에 참여해서는 안 된다.

(3).효소의 선택: 고화질 DNA 중합 효소 또는 PCR Mix (화물 번호: P517-05 또는 P814-05) 를 사용하는 것이 좋습니다.

(4).반응 조건: 일반적으로 구체적으로 사용되는 중합효소 설명서에 따라 진행하면 된다.

(5).삽입 부분 순화

l 선택사항: 조각이 입자 템플릿에서 유래하고 이 입자가 재조합 캐리어와 같은 저항성을 가지고 있는 경우, 순화 전에 Dpn I 내접효소로 입자 템플릿을 소화하면 배경을 낮추고 양성률을 높일 수 있다.

l 조각이 단일한 경우 PCR 생산물 순화 시약함 (화물번호: DC012-100) 으로 조각을 순화하는 것이 좋습니다.

l 비특이 증폭이 있는 경우 접착제로 시약함 (화물번호: DC011-100) 의 조각을 회수하는 것이 좋습니다.

l 이 방법을 사용하여 복제하면 선형화 담체에 사용되는 효소 절위점이 접합할 때 결핍될 수 있다. 만약 효소 절위점에 대해 엄격한 요구가 있다면 효소 절위점의 선택에 주의할 것을 건의한다. 필요할 경우정반향 복제 유인물의 중첩 구역 서열과 특이 유전자 서열 사이결핍된 알칼리기를 증가시켜 원래의 효소 절위점을 회복한다. (뒤의 예를 들어 설명하기 참조)

l 재조합 입자가 단백질 발현에 사용되는 경우, 유인물 설계 시 코드 판독, 단백질 발현 및 순화에 필요한 시퀀스 (예: 부팅 서브, RBS 시퀀스, 시작 암호 서브, 종료 암호 서브, 단백질 라벨 등) 가 파괴되지 않도록 주의하십시오.

양방향 유인물 설계 예제 설명(EcoR I 효소 절개):

위의 그림과 같이 캐리어는 Ecor I 효소에 의해 절개되어 5'돌출 말단을 형성합니다.

상술한 설계 원칙에 따라 3'단부터 계산하여 16bp-25bp (이 예는 20bp 말단이 같은 서열을 중첩하는 것을 사용했다) 로 되돌아가 목적 세그먼트의 특이 유인물 서열 앞에 추가하면 된다.중첩 영역의 Tm 값이 > 60 ° C(AT pair = 2 ° C and GC pair = 4 ° C)에서 일관되게 유지되도록 합니다.

양방향 유인물은 구체적으로 다음과 같다: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN 3'

참고: 위의 유인물 설계가 클론 연결을 완료하면 EcoR I 효소 절위점이 사라집니다 (효소 절위점은 유지되지 않음).

EcoR I 효소 절위점을 보존해야 할 경우, 운반체 말단 20bp 중첩 서열과 목적 세그먼트 특이 유인물 서열 사이에 누락된 EcoR I 식별 비트 서열 aattc를 보완해야 하며, 클론 연결을 완료한 후에도 EcoR I 효소 절위점은 여전히 존재합니다 (효소 절위점 보존).

구체적으로 다음과 같다: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

역방향 유인물 설계 예제 설명(Hind III 효소 절개):

위의 그림과 같이 캐리어는 Hind III 효소에 의해 절개되어 5'돌출 말단을 형성합니다.

상술한 설계 원칙에 따라 3'단부터 계산하여 16bp-25bp (이 예는 20bp 말단이 같은 서열을 중첩하는 것을 사용했다) 로 되돌아가 목적 세그먼트의 특이 유인물 서열 앞에 추가하면 된다.중첩 영역의 Tm 값이 > 60 ° C(AT pair = 2 ° C and GC pair = 4 ° C)에서 일관되게 유지되도록 합니다.

역방향 지시자는 다음과 같습니다. 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

참고: 위의 유인물 설계가 클론 연결을 완료하면 Hind III 절위점이 사라집니다 (효소 절위점은 유지되지 않음).

Hind III 효소 접점을 유지해야 하는 경우, 운반체 말단 20bp 중첩 시퀀스와 의도 세그먼트 특이 유인물 시퀀스 사이에 누락된 Hind III 식별 비트 시퀀스 agctt를 보완해야 하며, Hind III 효소 접점은 여전히 존재합니다 (효소 접점 유지).

구체적으로 다음과 같다: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

원활한 클론 반응 단계:

참고: 2 × OneStep Cloning Mix는 연결 강화제인 PEG가 들어 있어 끈적끈적하여 냉장고에서 꺼낼 때 온도가 낮을 때 더 끈적끈적합니다. 손바닥에 놓고 몇 분 동안 녹여 온도를 높이면 끈적끈적함 (품질에 영향을 주지 않음) 을 낮출 수 있습니다. 가볍게 섞고 순간적으로 원심을 분리하여 파이프 바닥으로 수집합니다.

1. 다음 표에 따라 반응 체계 구축 (PCR 튜브를 사용하여 실온에서 조제할 수 있음)

* 캐리어는 일반적으로 20-50 ng을 사용하며 삽입 조각과 캐리어의 몰비는 2: 1-3: 1 사이에서 가장 좋습니다;삽입 세그먼트가 200bp 미만이면 삽입 세그먼트와 캐리어의 몰비는 5: 1을 사용합니다.

2. 가볍게 섞어서 50에°C 반응 15분(PCR 기기에서 가능), 반응이 끝나면 PCR 튜브를 얼음에 설치한 후 직접 전환하거나 -20에 보관°C. 비교적 짧은 부분, 예를 들어 100bp-1kb는 15분이면 충분한 전환자를 얻을 수 있고, 비교적 긴 부분의 연결은 반응 시간을 60분까지 연장할 수 있다.

3. 반응산물 5μl를 취하여 감수성 세포설명서에 따라 전환(전환자가 적으면 모든 산물을 전환시키고 모든 전환액을 도판할 수 있다).

양성 클론 인증:

구체적인 상황에 근거하여 균락PCR감정을 선택하고 질립자 (화물번호 31013-100) 를 추출하여 제한성내절효소감정 또는 서렬분석감정을 진행할수 있다.

One Step Seamless Cloning Kit 원활한 클론 복제