빠른 1 단계 클로닝 키트

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제품 구성:빠른 1 단계 클로닝 키트

제품 소개

빠른 1 단계 클로닝 키트

재조합 원리에 기초한 빈틈없는 복제 기술은 차세대 복제 방법으로서 번거로운 효소 절단, 연결 절차에 의존하지 않고 말단 보충 평등 조작도 필요 없다. DNA 세그먼트와 선형화 캐리어 말단의 15~25nt 동원 서열의 재조합에 따라 삽입 세그먼트를 임의의 선형 캐리어의 임의의 위치로 복제할 수 있다. 캐리어 자체 연결 배경이 매우 낮고 간단하고 빠르며 효율적인 DNA 방향성 복제 기술이다.

빠른 1 단계 클로닝 키트한 번의 반응으로 한 번에 여러 DNA 조각의 재조합을 완료할 수 있는 원활한 복제 시약 상자는 빠르면 5분 만에 한 조각의 재조합을 완료할 수 있으며 양성률이 95% 보다 높다.Kit에 추가된 보조 계수는 클론 양성률을 효과적으로 높입니다.최적화된 반응 체계는 미순화 PCR 산물에 함유된 불순물을 어느 정도 견딜 수 있다.업그레이드 버전의 원활한 클론 키트는 더 높은 양성률과 더 나은 호환성을 제공합니다.

실험 절차

1. 실험 절차 개요

2. 선형 클론 캐리어 제조

적절한 클론 비트를 선택하여 캐리어를 선형화하면 캐리어의 선형화는 효소 절단 또는 역방향 PCR 증폭을 통해 완료 될 수 있습니다.

① 효소 절제

일부 제한적인 내접 효소는 초나선 DNA를 효과적으로 소화하지 못하기 때문에 절단되지 않은 운반체 DNA를 여러 개 남겨 양성률을 낮출 수 있다.LightNingTM 빠른 내접 효소를 사용하여 효소 절단 (단일 효소 절단 또는 이중 효소 절단) 을 수행하여 캐리어를 선형화하여 전환 배경 (절단되지 않은 캐리어 전환으로 얻은 가짜 양성 클론) 을 낮추는 것을 추천합니다.

주1: 효소절개를 거쳐 선형화된 담체는 인산화를 제거할 필요가 없으며 이중효소절개를 사용하는것을 추천한다.

주2: 효소 절단이 완료된 후, 내접효소를 부활시키거나 목적의 산물을 순화한 후 재조합 반응에 사용하는 것을 권장한다.

② 역방향 PCR 증폭 제조

증폭 돌연변이의 도입을 줄이기 위해 하이파이 PCR Mix를 사용하여 증폭하는 것을 추천한다.원형 입자 템플릿 잔류가 클론 양성률에 미치는 영향을 줄이기 위해 미리 선형화된 입자를 템플릿으로 사용하는 것을 권장합니다.

참고 1: PCR 산물이 비특이성 스트라이프가 없을 때, Template Eliminator (화물번호: EG21203) 소화 입자 템플릿을 사용하면 재조합 반응에 사용할 수 있는 것을 추천한다;대신 PCR 생산물을 순화해 사용하는 것이 좋습니다.

참고 2: 멀티세션 클론의 경우 PCR 결과물을 순화한 후 사용하는 것이 좋습니다.

3. 세그먼트 PCR 유인물 디자인 삽입

PCR 유인물의 5'끝에는 인접한 세그먼트 (삽입 세그먼트 또는 캐리어) 끝과 같은 소스의 15~25 nt (권장 18 nt) 시퀀스가 포함되어야 합니다.만약 캐리어가 점성 끝이고 3'단이 돌출된 경우 유인물 설계에는 돌출 부분이 포함되어야 합니다.5'끝이 강조 표시되면 지시물 설계에 강조 표시된 부분이 포함되거나 포함되지 않을 수 있습니다.

세그먼트 양의 증폭 지시물을 삽입하려면 다음과 같이 하십시오.

5'상류 캐리어 말단 동원 서열 + 효소 절위점 (선택 사항) + 유전자 특이성 순방향 증폭 서열 3'

세그먼트 역방향 증폭 지시자를 삽입하려면 다음과 같이 하십시오.

3'유전자 특이성 역방향 증폭 서열 + 효소 절위점(선택 사항) + 하류 캐리어 말단 동원 서열 5'

주1: 가능한 한 중복 서열이 없고 GC 함량이 균일한 구역을 선택하여 복제하고, 캐리어 복제 위치 상하류 25nt 구역 내 GC 함량이 40~60% 일 때 재조합이 높다;

참고 2: 이 키트에서 제공하는 pUC 19 캐리어(Ampr) 연결단의 시퀀스는 다음과 같습니다.

4. 세그먼트를 삽입하는 PCR 증폭

고화질 PCR Mix를 사용하여 증폭 돌연변이의 도입을 줄이기 위해 증폭하는 것을 추천한다.순화된 PCR 산물을 사용하여 빈틈없는 복제 반응을 하는 것을 권장하며, 만약 PCR 산물이 글리세린 겔 전영을 통해 특이성 증폭 산물로 감정되면 직접 사용할 수 있지만, 샘플링 부피는 총 반응 부피의 20% 를 초과해서는 안 된다.

5. 재조합 반응

① 빙수욕에 다음과 같은 반응체계를 배치한다.

a. 가장 적합한 캐리어 사용량(ng) = 0.02 × 캐리어 염기 대수, 즉 0.03 pmol.

b. 단일 세그먼트를 삽입하고 가장 적합한 세그먼트 사용량(ng) = 0.04 × 세그먼트 염기 대수;조각당 zui 적용량(ng) = 0.02 × 조각 염기 대수인 여러 조각을 삽입합니다.

참고 1: 삽입된 단일 세그먼트의 길이가 캐리어보다 크면 삽입된 세그먼트의 용량과 캐리어를 교환해야 합니다.

참고 2: 삽입 세그먼트의 길이가 200bp 미만이면 삽입 세그먼트는 캐리어 사용량의 5배를 사용해야 합니다.

참고 3: 위의 공식에 따라 계산된 사용량이 초과된 경우/ 최대값은 직접 누르는 것이 좋습니다.zui는/ 최대 사용량 사용;

참고 4: 캐리어 세그먼트가 너무 길거나 삽입 세그먼트가 너무 길거나 세그먼트 수가 너무 많으면 클론 양성률이 낮아집니다.

재조합 반응 체계의 조제가 완료된 후, 이액총으로 가볍게 빨아들여 각 조분을 골고루 섞고, 기포가 생기지 않도록 하며, 절대 소용돌이치지 말아야 한다.

② 반응체계를 50℃에 놓고 5~60min 반응한다.

주1: PCR 기기 등 온도 제어가 비교적 정확한 기기를 사용하여 반응하는 것을 추천하며, 반응 시간이 부족하거나 너무 길면 복제 효율이 떨어진다;

참고 2: 1~2개의 세션을 삽입할 때 권장 반응 시간은 5~15min입니다.3~5개 세션 삽입 시 권장 반응 시간은 15~30min입니다.

참고 3: 캐리어 뼈대가 10kb 이상이거나 삽입 조각이 4kb 이상인 경우 30~60min까지 반응 시간을 연장하는 것이 좋습니다.

주 4: 50 ℃ 반응이 완료되면 순간 원심분리를 하고 반응액을 관 밑으로 모으는 것을 권장한다.

③ 반응액 원심관을 얼음 위에 놓고 냉각한 후 전환하거나 -20 ℃ 에 저장한다.

참고 1: -20 ℃ 에 저장된 재조합 결과물은 1 주 이내에 사용하는 것이 좋습니다.

6.재조합 산물 전환

반응액 5~10μl를 취하여 100μl의 감수성 세포에 넣고 천천히 빨아들여 섞어 얼음 위에 30min 놓는다.42℃ 핫팩 45~60 sec, 빙욕 5min.SOC 또는 LB 배지 500μl를 더하고 37℃ 진동배지 40~60min(200rpm).균액을 대응항생제가 함유된 평판에 균일하게 도포하고 37 ℃ 에 거꾸로 놓고 밤을 새워 배양한다.

주1: 서로 다른 감수성 세포의 마지막 복제 양성률은 차이가 있을 수 있으며, 전환 효율 > 108CFU/μg의 감수성 세포를 사용하는 것을 추천한다;

주2: 균락수는 PCR 산물과 선형화 캐리어의 수량과 순도에 달려 있다;

주3: 양성대조판은 일반적으로 대량의 백색단균락이 생장하고 음성대조판은 아주 적은 균락만 생장한다.

7. 양성 클론 검사

단균을 10μl ddH2O에 떨어뜨려 골고루 섞고 95 ℃ 로 10min 분해한 후 1μl 분해액을 거푸집으로 취하여 균락 PCR 감정을 진행하거나 단균락을 항성배지에 접종하여 밤새 배양한 후 입자를 추출하여 효소 절단 감정을 진행한다.

양성 대조의 양성 복제 검사, 균락 PCR 유인물은 범용 유인물 M13F와 M13R, 효소 절단용 HindIII와 EcoRI를 사용한다.

주1: 균이 PCR에 떨어질 때 적어도 하나의 통용유인물을 사용하여 가양성결과를 피면할것을 건의한다.

주2: 필요할 때 양성 결과에 대해 서열 검사를 진행할 수 있다.

注3：M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R : CAGGAAACAGCTATGAC

미국 Azaood사는 2004년에 설립되였는데 생명과학연구, 진단 및 생물기술응용에 사용되는 고품질의 순화효소, 단백질, 핵산 및 세포분리시약함, 태우혈청을 개발하고 생산하는 업종의 lingdao자이다.Azood Corporation은 ISO9001 인증을 통과한 주요 제조업체로 연구부터 대규모 대량 바이오 가공 및 OEM 응용 프로그램 및 요구 사항을 충족 할 수 있습니다.