무세포 단백질 표현 시약함-이황 결합 증강판-동결건조분

상품 번호：P0243L

스토리지 기준：-80℃，1년유효

드라이아이스 운송.개봉 후 무세포 단백질 발현 반응 성분을 -80 ℃ 에 저장한다.반복적인 동융을 피하기 위하여 반응용량에 따라 A액과 B액을 각각 분장한후 액질소로 속동한후 다시 -80 ℃ 에 넣어 저장할수 있다.

제품 그룹

제품 설명

무세포 단백질 합성 시약 키트(Cell-Free Protein Synthesis Kit)는 1대장균 세포 분해액을 기반으로 체외 단백질을 합성한 제품.이 제품 활용세포분해액 중의 핵당체, 번역인자, 효소 등 활성물질은 동시에 에너지,뉴클레오티드, 아미노산, 무기염 등, 체외 재구성 전사- 번역 체계.DNA 또는RNA는 단백질을 나타내는 템플릿입니다.무세포 단백질 발현은 생균에 의존하지 않고단백질을 빠르고 유연하게 대량으로 표현할 수 있어 전통적인 재조합 표현 체계에 비해 많은 사람들이다양한 이점:

1. 단백질 발현이 빠르고 1~2h면 목적 단백질을 발현할 수 있으며 8~24h면 최대에 도달할 수 있다대량.

2. 단백질 발현량이 높고 가장 가오는 3mg/ml 이상의 단백질에 도달할 수 있다.

3.반응은 간단하고 유연하다.반응 체계에 DNA 또는 RNA 템플릿을 추가하기만 하면 된다.사용96공판이나 원심관이 반응한다.

주: 본 상품호 제품은 일반 단백질을 표현할 수 있으며, 이황 결합을 함유한 단백질을 표현하는 데 더욱 적합하다.

적용 범위

제품진은 전문인원의 과학연구용에 국한되며 림상진단이나 치료에 사용되여서는 안되며 식품이나 약품에 사용되여서는 안된다.

작업 설명

1. 유전자 구축

목적 유전자의 구축은 단백질 표현에 매우 중요하므로 아래 그림의 구축 방식을 사용하는 것을 추천한다.목적 유전자를 본 시약함에 첨부된 양성 입자에 구축할 수 있다(입자 도표는 외부 포장 라벨이 QR코드 내 파일을 스캔하는 것을 참조한다), 즉 다음과 같은 구축 방식이다.pET9a, pET-23a 등 T7 시동자는 포함되지만 유당 조종자(lac)는 포함되지 않은 PET 계열 입자와도 호환된다.

참고: lac 유당 조종자가 함유 된 입자 (예: pET28a 등) 는 생산량에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 직접 사용하는 것이 권장되지 않습니다.

양성 입자의 DNA 서열 설명도는 다음과 같다.：

2. 템플릿 준비

무세포 단백질 합성 시약함은 DNA나 mRNA를 템플릿으로 사용하여 재조합 단백질을 표현할 수 있다.채택된 DNA 템플릿은 입자일 수도 있고, PCR 산물일 수도 있고, phi29를 사용하여 RCA 롤링 증폭을 하는 산물일 수도 있다.

2.1 입자: 유전자회사를 통해 합성하거나 아크론을 통해 무세포반응에 적용되는 입자를 획득하고 기둥순화방식으로 입자를 추출한다.

2.2 PCR 결과물: 설계 유인물, 순방향 유인물은 T7 시동자 상류 200bp 정도, 역방향 유인물은 종료 암호자 하류 200bp 정도 (T7 terminator 포함) 로 템플릿을 증폭시켜 얻은 DNA 선형 조각을 순화 없이 무세포 반응 체계에 직접 투입할 수 있다.상하류 200bp 염기는 내원성 외절효소에 의해 DNA 선형 조각이 분해되지 않도록 보호하는 역할을 한다.

2.3 RCA 생산물: phi29 중합효소, 무작위 6인용물을 사용하여 롤링 링 증폭 RCA를 진행하며, 획득한 DNA 산물은 무세포 반응 체계에 직접 사용할 수 있다.

2.4 PCR과 RCA는 Golden Gate 및 Gibson Assembly와 함께 사용할 수 있어 DNA 템플릿 제조의 속도와 통량을 크게 향상시킬 수 있습니다.

2.5DNA 템플릿을 사용하기 전에 정확한 정량이 필요합니다.RNase A 도입을 피하기 위해 고품질의 입자 추출 시약함을 사용하여 입자 추출을 수행하는 것이 좋습니다.유전자 합성 회사가 반환하는 입자는 기둥 순화 방식을 사용하는 것을 강조해야 한다. 그렇지 않으면 무세포 반응에 직접 사용할 수 없다.

3. 무세포 단백질 발현

3.1반응체계 총량 계산에 필요한 A액과 B액(체적비 1:2)을 토대로 사용된 시약을 얼음에 반응용기(예를 들어 원저원심관 2ml)에 첨가하고 섞는다.조작과정은 전반 과정에 장갑, 마스크를 착용하고 효소원이 없는 이액기 흡두와 반응용기를 채용하여 핵산효소가 도입되지 않도록 해야 한다.

무세포 반응 체계는 다음 표를 참조하여 혼합 조제할 수 있다.

3.2반응 체계에 템플릿 DNA를 추가하면 DNA 템플릿의 첨가 최종 농도가 5~10μg/ml로 DNA 템플릿 첨가량을 최적화할 수 있다고 추천한다.

3.3반응 용기를 일반 흔들침대나 항온 혼합기에 넣어 무세포 단백질 발현을 하는데 권장 반응 온도는 25∼30도다.온도를 낮추면 단백질의 합성 속도는 떨어지지만 단백질의 가용성은 증가한다.일반적으로 8h 정도 반응하면 최대 da의 단백질 생산량에 도달할 수 있으며, 밤을 새워 16h까지 반응할 수도 있다. 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 적당히 늘려야 한다.

3.4무세포 단백질 발현에는 충분한 산소가 필요하며, 원저 원심관 2ml를 반응 용기로 사용할 때 반응 체계는 100μl를 넘지 않는다.무세포 단백질 반응은 같은 비율로 증폭될 수 있으며, 증폭된 반응 체계는 요강 등 더 큰 반응 용기를 사용하는 동시에 요강의 회전 속도(200rpm)를 보장해야 한다.

4. 체크

반응이 끝나면 반응액(전체 단백질 검출) 또는 반응상청(가용성 단백질 검출) 1μl 정도를 채취해 SDS-PAGE 단백질 겔 전영 검출 목적 단백질의 발현을 한다.

5.양성 대조

이 시약함에는 녹색 형광단백질 sf-GFP 입자가 양성 대조로 있어 육안으로 반응 결과를 직접 관측할 수 있다.sf-GFP가 성공적으로 발현되면 무세포 반응 체계가 뚜렷한 녹색을 나타낼 것이다.

sf-GFP를 정밀하게 측정하려면 효소 측정기를 사용하여 검사할 수 있습니다(Ex/Em=485/528nm).