쌍형광소 효소 보고 유전자 검사 시약함

Firefly & Renilla Assay Kit(파이어플라이 & 레니라 시험 키트)쌍형광소 효소 보고 유전자 검사 시약함) 유전자의 발현량을 검사하는 효과적인 수단을 제공하며, DLR 검사에서 반딧불이 형광소 효소(Firefly luciferase)와 하이신 형광소 효소(Renilla luciferase)의 활성은 단일 샘플에서 순차적으로 검사할 수 있다.먼저 루시퍼린(Luciferin)을 바탕물로 반딧불이 형광소 효소의 활성을 측정한 후 반딧불이 형광소 효소의 촉매를 억제하는 물질을 첨가하는 동시에 캡사이신(Coelenterazine)을 첨가하여 하이신 형광소 효소의 활성을 측정하여 쌍반딧불 효소 보고 유전자 검사를 실현한다.형광소 효소와 그 바탕물이라는 생물 발광 체계를 통해 유전자의 발현을 매우 민감하고 효율적으로 검사할 수 있다.일반적으로 관심 있는 유전자의 전사 조절 소자나 5'가동 서브존을 루시어스 상류에 복제하거나 3'-UTR존을 루시어스 하류에 복제해 보고유전자(Reporter gene) 입자로 구축한 뒤 세포를 전염시켜 적절한 약물 등으로 세포를 처리한 후 세포를 분해하고, 형광소 효소 활성의 높낮이를 측정해 약물 처리 등 목적 유전자에 대한 전사 조절 작용을 판단한다.하이신 형광소 효소는 세포 수와 전염 효율의 차이를 없애기 위해 전염 효율을 측정하는 내삼으로 더 많이 사용된다.
반딧불이 형광소 효소는 분자량이 약 61kD인 단백질로, ATP, 마그네슘 이온, 산소가 존재하는 조건에서 형광소를 촉매해 산화반딧불이(Oxyluciferin)를 생성하고, 형광소가 산화하는 과정에서 광신호를 생성한다.하이신 형광소 효소는 분자량이 약 36kD인 단백질로, 산소가 존재하는 조건에서 캡사이신을 장아미드(Coelenteramide)로 산화하도록 촉매할 수 있으며, 캡사이신이 산화하는 과정에서도 광신호가 생성된다.이 시약함의 광신호는 화학발광기, 효소표시기 또는 액섬측정기를 통해 측정할수 있다.이 시약함은 검측이 신속하고 민감도가 높으며 검측범위가 넓고 세포내원활성교란이 없는 등 특점이 있다.
제품 특징:
빠른 속도: 세포 분해는 10-15 min 이내에 완료됩니다.
편리함: 시약은 쉽게 조제할 수 있고 샘플 검사 절차는 간단하다.
민감성: zui 낮음 10 감지 가능-20mol의 형광소 효소.
효소의 농도는 선형 범위가 8개의 수량급에 달한다.
제품 그룹:

1. 세포 분해
(1) 배양기를 제거하고 PBS를 추가하여 가볍게 두 번 세척한다 (벽에 붙인 세포는 직접 이 조작을 할 수 있으며 부유 세포는 원심에서 세포를 수집해야 한다).다음 시나리오에 따라 1 × Lysis Buffer(무균수로 4: 1 희석 성분 A)를 넣은 다음 배양판을 마이크로 발진기에 놓고 실온으로 15 min 진동하여 세포를 충분히 분해합니다.
주: 분해산물은 실온에서 6h, -70 ℃ 로 장기간 보관할 수 있다 (분해산물은 반복적으로 얼려서는 안 된다).
(2) 분해산물 10000-15000rpm 원심분리 3-5min, 원심분리 후 상청액을 새로운 EP관에 옮겨 후속 검사를 진행한다.
주: 세포가 분해되면 즉시 검사할수도 있고 동존할수도 있으며 필요할 때 다시 검사할수도 있다.냉동 보관 샘플은 실온까지 녹인 후 다시 검측을 진행해야 한다.
2. 작업액 조제
(1) 모든 성분을 실온으로 회복한다.
(2) 조분 B로 조분 C를 충분히 용해하여 0.2mg/mL의 반딧불이 형광소 효소 작업액을 조제한다.
주: 반딧불이 형광소 효소 작업액은 반복적으로 얼려서는 안 되며, 만약 1회 실험 용량이 비교적 적다면, 1회 사용량에 따라 작은 규격으로 나누어 설치하는 것을 권장한다.
(3) 조분 D로 조분 E를 해신 형광소 효소 작업액으로 희석하고, 희석 방법은 1 ul E 조분을 49 µL D 조분에 첨가한다.
주: 하이신 형광소 효소 작업액은 즉시 사용하고 즉시 배합해야 한다.
3. 화학 발광치 검측
(1) 계기조작설명서에 따라 화학발광기능을 검측하는 계기, 례를 들면 다기능효소표시기를 열고 매개 변수를 설정하며 측정시간은 10s이고 측정간격은 2s이다.
(2) 각 샘플을 측정할 때 샘플을 20-100 ul (샘플의 양이 충분하면 100 ul을 추가하십시오. 샘플의 양이 부족하면 용량을 적당히 줄일 수 있지만 검측 구멍의 용량은 일치해야 합니다.)1 × Lysis Buffer는 공백 대조입니다.
(3) 100ul 반딧불이 형광소 효소 검출액을 넣어 RLU(relative light unit) 값을 측정한다(효소 표시기에 Shaking 혼합 기능 설정 권장).
참고: 이 발광은 순간 발광이므로 반딧불이 형광소 효소 작업액을 넣은 후 즉시 검사하는 것이 좋습니다.
(4) 해신 형광소 효소 작업액 100ul을 넣어 RLU(relative light unit) 값을 측정한다(효소 표시기에 Shaking 혼합 기능 설정 권장).
(5) 하이신 형광소 효소를 내삼으로 하는 상황에서 반딧불이 형광소 효소로 측정한 RLU 값을 하이신 형광소 효소로 나눈 RLU 값.얻은 비율에 따라 서로 다른 샘플 간의 목적을 비교하여 유전자의 활성화 정도를 보고한다.반딧불이 형광소 효소를 내삼으로 하면 비슷한 계산을 할 수도 있다.

-20 ℃ 보존.C조분은 미리 무균수를 사용하여 2mg/mL 저장액, B조분, D조분 및 저장액으로 구성된 C조분을 배치하는 것을 권장한다.
실험 수요에 따라 소량 분장을 진행하다.모든 검측 작업액은 반복적으로 얼지 않도록 즉시 배합하여 사용할 것을 건의한다.

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