새 행표 대응 - NY/T 4630-2025 우유 및 그 제품에서 알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 측정

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날짜:2025-05-27읽기 :1

머리말

생우유에는 알파-유백단백질(α-Lactalbumin), 베타-유구단백질(베타-Lactoglobulin), 락토프리닌(Lactoferrin, LF), 면역글로불린G(Immunoglobulin G, IgG), 락토프리다제(Lactoperoxidase, LP) 등 다양한 천연 활성 단백질이 풍부해 바이러스 침입과 면역력 증진, 면역력 증진 등에 중요한 역할을 한다.이 중 알파-유백단백질은 항암, 항균, 항바이러스 작용을 하며 면역기능을 조절하고 유당 합성과 유분비를 촉진한다.베타-유구단백질은 콜레스테롤을 낮추고 항산화와 항바이러스 활성을 가지고 있으며 지용성 비타민의 소화흡수를 촉진한다.서로 다른 열처리 방식 (배스 살균, 초고온 (UHT) 멸균, 증발 농축 및 스프레이 건조 등) 은 유제품에서 알파-유백단백질과 베타-유구단백질이 서로 다른 정도의 변성 불활성을 초래하여 그 영양가 및 시장 판매가에 영향을 줄 수 있다.

새머비 새 행표 대응방안 하이라이트

1.이 시험은 NY/T 4630-2025 및 관련 단체 표준과 기업 표준을 참고하여 바씨살균유, 초고온 멸균유와 영유아 조제분유의 알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 함량을 측정한다.NY/T 4630-2025 2025년 5월 1일 공식 시행。

2. 이 시험은 2.6μm 입경의 실심 핵 입자 Accucore 150 C4 크로마토그래피 기둥을 사용하여 더 낮은 유속(0.8 ml/분), 더 작은 샘플링 볼륨 (10 μL) 및 더 높은 샘플링 빈도 (10 Hz알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 봉형 및 분리도는 모두 기준 때문이다.

3. 좋은 봉형과 분리도를 얻기 위하여 시험은 샘플 전처리와 액상 크로마토그래피 조건을 적당히 최적화하여 기둥온도 60 ℃, 유속 0.8 mL/min 조건에서 0.1% 삼불화에틸산수 -0.1% 삼불화에틸아크릴을 유동상으로 경도 세척하고 시스템 최대 압력치는 초과하지 않는다110 바。

4. 시험 결과 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 크로마토그래피는 봉형이 양호하고 기둥효과가 우수하며 분리도가 탁월하며 그중에서도알파-유백단백질 주봉과 부근 간섭봉의 분리도는 표준 스펙트럼보다 현저히 우수하다알파-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액(100μg/mL), 알파-유백단백질 보존시간은 21.900min, 비대칭인자 0.98, 이론탑판수 321137;베타-유구단백질 B 보존시간은 24.747min, 비대칭인자 1.01, 이론탑판수 352451;베타-유구단백질 A 보존시간은 25.467min, 비대칭인자 1.00, 이론탑판수 373359;알파-유백단백질과 베타-유구단백질 B의 분리도는 17.77, 베타-유구단백질 B와 베타-유구단백질 A의 분리도는 4.33이다.연속 4회 샘플링, 보존 시간과 피크 면적의 RSD는 모두 0.3% 미만으로 방법 재현성이 좋다;알파-유백단백질 표준품 용액 선형범위 0.00-200μg/mL, 선형상관계수 r²≥0.9997, 베타-유구단백질 표준품 용액 선형범위 0.00-200μg/mL, 선형상관계수 r²≥ 0.9991, 선형 양호.

5. 반상액 크로마토그래피로 유제품의 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 함량을 측정하는 실험에서Accucore 150 C4는크로마토그래피 기둥은 Vanquish Core 고효율 액상 크로마토그래피 시스템과 결합하여 양호한 재현성과 우수한 안정성을 나타냈으며, 방법 검출 제한과 정량 제한은 모두 표준 요구를 만족시켰으며, 유제품 기업 및 식품 검측 실험실에서 참고할 수 있다.

6.관련 문헌을 참고하여 겔침투크로마토그래피로 유제품의 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 함량을 측정하는 실험에서 직렬로 두 가지를 사용하였다MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm)부피 저항 크로마토그래피 기둥으로 6M 염산구니딘을 유동상으로 등도 세척하여 280nm에서 알파-유백단백질과 베타-유구단백질을 효과적으로 분리할 수 있다.

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뉴욕/T 4630-2025

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샘플 전처리

1.1 액체 시료: 저온유(생우유, 바실살균유)/상온유(초고온(UHT) 멸균유)

시료 5 g (0.1 mg까지 정확함) 을 50 mL 대 눈금 회전 덮개 원심관에 적당량의 물 소용돌이 혼합 30s, 적당량의 아세트산 조절 pH를 4.60 ± 0.05로 한 후, 물 정용 25.0 mL, 소용돌이 혼합 1 min, 정지 30 min 이상, 12000 rpm 4 ℃ 원심 15 min.청액 (재량껏 초순수로 희석할 수 있음), 0.2μm 친수성 PTFE 마이크로홀 여과막 (P/N: 42213-NPL) 을 채취하여 여과액을 기계 테스트에 대기한다.

1.2 고체 시료: 유분(영유아 조제분유)

시료 2g (0.1mg까지 정확함) 을 50mL 대 눈금 회전 덮개 원심관에 적당량의 물 소용돌이를 1min 섞어 충분히 용해(필요시 온수욕으로 녹일 수 있음), 적당량의 아세트산으로 pH를 4.60±0.05로 조절한 후 물을 25.0mL로 정용하고 소용돌이를 1min, 정적 30min 이상, 1200rp4 ℃ 로 정한다.청액 (재량껏 초순수로 희석할 수 있음), 0.2μm 친수성 PTFE 마이크로홀 여과막 (P/N: 42213-NPL) 을 채취하여 여과액을 기계 테스트에 대기한다.

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계기 배치 및 크로마토그래프 조건

Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 고효율 액상 크로마토그래피 시스템, 구성: 펌프 Quaternary Pump C(VC-P20-A), 자동 샘플러 Split Sampler CT(VC-A12-A), 기둥 온도 상자 Column Compartment C(VC-C10-A), 검출기 Diode Array Detector CG(VC-D11-A), 데이터 처리 Chromeleon™ 7.3

크로마토그래피 기둥: Accucore 150 C4, 2.6 μm, 4.6 × 150 mm (P/N: 16526-154630)

흐름상: A: 0.1% 트리플루오로에틸산수 B: 0.1% 트리플루오로에틸아크릴

유속:0.8mL/분

그라데이션 워싱 프로그램:

샘플링 양:10µL

기둥 온도: 60 ℃

검출기: DAD, 채집 파장: 210nm, 채집 주파수:10Hz; 스펙트럼 수집: 190-400nm

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스펙트럼 및 데이터

3.1α-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액의 분리 스펙트럼 및 데이터

그림 1α-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액의 분리 스펙트럼 및 데이터 (100μg/mL)(큰 그림을 보려면 클릭)

그림1에서 볼 수 있듯이 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 크로마토그래피는 봉형이 양호하고 기둥효과가 우수하며 분리도가 표준보다 우수하다.알파-유백단백질 보존시간은 21.900min, 비대칭인자 0.98, 이론탑판수 321137;베타-유구단백질 B 보존시간은 24.747min, 비대칭인자 1.01, 이론탑판수 352451;베타-유구단백질A 보존시간은 25.467min, 비대칭인자 1.00, 이론탑판수 373359이다.알파-유백단백질과 베타-유구단백질 B의 분리도는 17.77, 베타-유구단백질 B와 베타-유구단백질 A의 분리도는 4.33이다.

3.2α-유백단백질과 베타-유구단백질 단일표준품 용액 포지셔닝 중첩 스펙트럼

그림 2α-유백단백질과 베타-유구단백질 단일표준품 용액 포지셔닝 중첩 스펙트럼 (큰 그림 보기 클릭)

알파-유백단백질과 베타-유구단백질 단일 표지 위치 크로마토그래프 및 스펙트럼도, 그림 2와 같이 알파-유백단백질, 베타-유구단백질 B와 베타-유구단백질 A는 모두 200nm와 279nm에서 특징적으로 흡수된다.

3.3α-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액 연속 입체 중첩 스펙트럼

그림 3α-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액 연속 입체 중첩 스펙트럼 (100μg/mL, n=4) (큰 그림 보기 클릭)

알파-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액(100μg/mL)은 4회 연속 샘플을 넣었고, 보존 시간과 피크 면적의 RSD는 모두 0.3% 미만으로 방법 재현성이 좋으며, 분리 스펙트럼 및 데이터 상세도는 그림 3을 참조한다.

3.4α-유백단백질과 베타-유구단백질 표준품 용액 교정곡선 중첩 스펙트럼

그림 4α-유백단백질과 베타-유구단백질 표준품 용액 교정곡선 중첩 스펙트럼 (0.00/40.0/80.0/120/160/200μg/mL) (큰 그림 보기 클릭)

생우유, 바씨살균유에는 알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 함량이 일반적으로 높기 때문에 T/TDSTIA 002-2021과 T/TDSTIA 007-2019 두 단체 표준이 추천하는 선형 범위를 선택했다.그림 4에서 볼 수 있듯이 알파-유백단백질 표준품 용액 선형 범위 0.00-200 μg/mL, 선형 상관계수 r²≥0.9997, 베타-유구단백질 표준품 용액 선형범위 0.00-200μg/mL, 선형상관계수 r²≥ 0.9991, 선형 양호.이 중 베타-유구단백질 B와 베타-유구단백질 A는 화합물 그룹으로 정량한다.

3.5α-유백단백질과 베타-유구단백질 표준품 용액(40.0μg/mL)과 공백용액 중첩 스펙트럼

그림 5α-유백단백질과 베타-유구단백질 표준품 용액 (40.0μg/mL) 과 공백 용액 중첩 스펙트럼 (큰 그림 보기 클릭)

샘플의 부피가 10uL일 때 알파-유백단백질과 베타-유구단백질(40.0μg/mL)의 최고를 S로 하고 22.5-24.0min 기질소음의 평균을 N으로 한다. 알파-유백단백질, 베타-유구단백질B와 베타-유구단백질A의 신호비는 S/N이 각각 523.3, 139.9, 133.6으로 그림5와 같다.따라서 샘플링 부피의 최적화와 함께 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 측정 방법의 민감도도 NY/T 4630-2025에서 1.00μg/mL의 요구를 충족시킬 수 있다.

3.6α-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액과 바씨살균유 샘플 용액 중첩 스펙트럼

그림 6 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 혼합 표준품 용액과 바씨살균유 샘플 용액 중첩 스펙트럼 (큰 그림 보기 클릭)

유청 단백질 외에도 우유에는 카제인과 기타 단백질이 많이 함유되어 있어 알파-유백 단백질과 베타-유구 단백질의 측정에 방해가 될 수 있다.바씨살균유 샘플은 pH, 고속원심분리 등 전처리조작을 조절한후 변성되지 않은 알파-유백단백질과 베타-유구단백질은 상청액에 보존되였는데 그 분리보존의 봉형이 비교적 좋고 기선이 평온하며 봉우리를 벗어날 때 교란이 없다. 그림6과 같다.외표법정량을 채용하여 바씨살균유 견본에서 알파-유백단백질은 1033.6mg/kg이고 베타-유구단백질 함량은 2949.0mg/kg으로 기본적으로 라벨값과 부합된다.

3.7 바씨살균유(저온유), 초고온멸균유(상온유) 및 영유아 조제분유 샘플 용액 분리 스펙트럼 및 데이터

그림 7 바씨 살균유 (저온유) 샘플 용액 분리 스펙트럼 및 데이터

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그림 8 초고온 멸균유 (상온유) 샘플 용액 분리 스펙트럼 및 데이터

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그림 9 영유아 조제분유 샘플 용액 분리 스펙트럼 및 데이터

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알파-유백단백질과 베타-유구단백질은 온도에 민감하며 고온은 화학구조 및 생물활성을 파괴한다.그림7-9에서 볼 수 있듯이 바씨살균유 (저온유) 중 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 목표봉 부근에는 모두 뚜렷한 교란봉이 존재하지 않으며 확정성과 정량을 준할 수 있으며 생우유, 바씨살균유 등 샘플은 NY/T 4630-2025 제1법에 적용된다.반면 초고온 멸균유 (상온유) 와 영유아 조제분유 중 베타-유구단백질 목표봉 부근에는 뚜렷한 교란봉이 존재하여 정성과 정량 결과에 심각한 영향을 줄 수 있다. 알파-유백단백질은 상대적으로 영향을 적게 받는다. 초고온 멸균유, 영유아 조제분유 등 샘플은 NY/T 4630-2025 제1법에 적용되지 않는다. 제2법을 채택할 것을 건의한다.

3.8α-유백단백질과 베타-유구단백질 표준용액 겔침투 크로마토그래프(제2법)

그림 10 알파-유백단백질과 베타-유구단백질 표준용액 (500mg/L) 겔침투크로마토그래프 (큰 그림 보기 클릭)

두여운 선생님이'중국유제품공업'저널에 발표한 글'부피저항크로마토그래피로 우유, 유분, 유청분말의 알파-유백단백질 함량 측정'(2022년)을 참고하여 MAbPac SEC-1(300Å, 5μm, 7.8×300mm) 부피저항크로마토그래프 기둥 두 개를 직렬로 사용하여 6M 염산구니딘을 유동상백단백질 및 베타-유백단백질 분리 테스트 방법 등 80회 및 유청분유 10회 유효성을 검증하였으며, 베타-유백단백질 분리 방법은 베타-분유 80도와 같다. 및 안정성, 관련 스펙트럼 및 데이터는 원문을 참조한다.

이 문서에서 선택한 MAbPac SEC-1 크로마토그래피 기둥 사양은7.8×300mm，권장 유속 0.5mL/min, 분리도 확보 전제하에 용매 절감, 선택 가능4.0×300mm 규격 크로마토그래피 기둥, 권장 유속 0.2 mL/min (적당히 조정 가능).

NY/T 4630-2025 관련 크로마토그래피 소모품 추천

4.1 제1법 반상액 크로마토그래피 분석기둥 및 보호기둥
Accucore 150 C4의 2.6 μm, 4.6×150 mm	(번호: 16526-154630)
Accucore 150 C4 보호 기둥 코어, 2.6 μm, 4.0 × 10 mm, 4 pk	(번호: 16526-014005)
Uniguard 직접 연결 보호 기둥 커버	(P/N: 850-00)

4.2 제2법 겔침투크로마토그래피 분석기둥 및 보호기둥

유속:0.5mL/분
保护柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm	(번호: 074697)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm	(번호: 088460)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm	(번호: 088460)

유속:0.2mL/분
保护柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm	(번호: 074697)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm	(번호: 074696)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm	(번호: 074696)

4.3 샘플 전처리
Titan 3 친수성 PTFE 핀 필터, 17mm, 0.2μm, 200/pk	(번호: 42213-NPL)

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참고문헌

[1] NY/T 4630-2025 우유 및 그 제품 중 알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 측정 고효율 액상 크로마토그래피

[2] T/TDSTIA 026-2022 영유아 조제분유 중 알파-유백단백질, 베타-유구단백질의 측정-겔침투크로마토그래피

[3] T/TDSTIA 002-2021 유제품 및 유제품 중 알파-유백단백질의 측정 고효율 액상 크로마토그래피

[4] T/CSIQ 77001-2020 유제품 중 알파-유백단백질 함량 측정 고효율 액상 크로마토그래피

[5] T/TDSTIA 007-2019 유제품 및 유제품 중 베타-유구단백질의 측정액 크로마토그래피

[6] T/SHNX 001-2025 생우유 중 락틴, 알파-유백단백질과 베타-유구단백질의 측정액 크로마토그래피-직렬 질량분석법

[7] 두여운, 왕량, 린이칸.부피 저항 크로마토그래피는 우유, 유분, 유청분 중 알파-유백단백질의 함량을 측정한다[J]. 중국유제품공업, 2022, 50(04): 46-51.

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