최근 중국 과학원 상하이 약물 연구소는국제 제약학 저널'나노 소재 크기와 농도의 핵심 매개변수를 표준화한 나노입자 추적 분석'이라는 제목의 글이 게시됐다.이 연구에서 저자는 샘플 구성, 샘플 농도, 기기 설정 매개변수, 카메라 설정 매개변수, NTA(NanoSight NS300) 측정 정확성에 대한 액체 유속의 영향을 체계적으로 평가했다.연구 과정에서 그들은 입자 입경 표징의 금 표준인 투과 전자 현미경과 저항 기반 펄스를 동시에 선택했다감응(RPS) 원리의NanoCoulter는나노쿠르트 입도 분석기는 NTA의 입자 입경 및 농도 측정 정밀도를 교차 검증하는 직교 실험을 한다.

입자 농도에 따른 측정 결과의 정확성 비교

그림 1 샘플 농도가 NTA 측정 결과에 미치는 영향.

저자는 다양한 크기의 폴리스티렌(PS)과 이산화규소(SiO)를 사용했다₂) 표준 입자, 입자 농도에 따라 측정하고 농도에 따라 평균 크기와 농도 편차를 비교했다.결과 표시,입자의 농도가10⁸-10⁹ particles/mL 간에는 측정 결과가 가장 정확하고 선형 추세가 가장 좋습니다.이때 해당 시야의 입자 수는 10-100과 400-6500개다.

서로 다른 노출도가 측정 결과에 미치는 영향 비교

그림2. NTA 측정 결과에 대한 노출의 영향

NTA는 DLS와 달리 카메라로 입자의 실시간 브라운 움직임을 추적해 입자 입경 계산을 한다.그래서카메라 설정 매개변수를 최적화하면 크게 향상됩니다.NTA가 측정한 입경과 농도의 정확성.저자는 혼합된 다양한 크기의 PS 입자를 사용해 다양한 노출도(camera level)에서 표징했다.노출도는 입자 움직임에 대한 카메라의 민감도를 나타내는 매개변수다.노출도를 조절함으로써 NTA의 사진 촬영 결과에 영향을 줄 수 있다.그 결과 노출도가 6~9일 때는 100nm의 PS입자가 잘 관측되지 않는 반면 200nm의 PS입자는 선명하게 보이고, 노출도가 10-14일 때는 100nm의 PS입자가 선명하게 관측되는 반면 200nm의 PS입자는 지나치게 노출돼 결과에 영향을 미치는 것으로 나타났다.이어 저자는 노출도가 100nm, 120nm, 150nm, 170nm와 200nm의 PS 입자의 입경 피크 및 분포에 대한 표징을 추가로 평가했다.그 결과 노출도 변화는 PS 입자의 입경 최고치에 큰 영향을 미치지 않았지만 노출도가 상승하면서 각 그룹의 PS 입자의 입경 평균치가 상승했다.그래서 저자는 구체적으로크기가 다른 입자는 노출도와 함께 입자 지름의 측정 결과에 영향을 줄 수 있다。샘플의 분산도가 큰 경우NTA 카메라는 모든 입자를 찍을 수 있도록 적절한 노출도를 찾기 어렵다.관련 보고서를 작성할 때는 NTA의 노출도 등 설정 매개변수를 함께 제출해 데이터 투명성을 확보해야 한다.

서로 다른 펌프 속도가 측정 결과에 미치는 영향 비교

이전 연구에 따르면용액의 점도가 영향을 줄 수 있다NTA 측정 결과의 정확성그러나 펌프 속도가 측정 결과에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 알 수 없기 때문에 저자는 크기가 다른 PS 입자를 사용하여 펌프 속도에 따라 측정하고 속도에 따라 평균 크기와 농도 편차를 비교했다.결과 표시,보다 작은 경우200 nm 입자, 펌프 속도 50 AU(임의적 단위 (arbitrary unit)내부적으로는 비교적 정확한 결과를 얻을 수 있지만, 더 큰 입자에 대해서는 더 낮은 펌프 속도가 있어야 정확성을 보장할 수 있다.

그림4. NTA, DLS 및 RPS의 다중 분산 샘플 측정영향

그 후 이러한 결과를 바탕으로 저자는 이 표준 운영 프로세스에 따라 다중 분산 샘플에 대한 NTA의 표징 능력을 평가했습니다.저자는 1: 1과 10: 1 (농도비) 의 100nm와 150nm PS 입자 혼합물을 제조했는데, NTA는 노출도에 따라 7-10의 범위 내에서 두 샘플에 대해 두 개의 입자 지름 피크를 순조롭게 측정할 수 있었다.그 후 저자는 1: 1: 1의 100 nm, 150 nm 및 200 nm 및 1: 1: 1의 100 nm, 150 nm, 170 nm 및 200 nm의 3 혼합 및 4 혼합 샘플을 추가로 제조했으며, 그 결과 NTA는 측정을 완료 할 수 없으며 넓은 피크 하나만 얻을 수 있음을 나타냅니다.그 후 저자는 DLS와 RPS를 사용하여 위의 네 가지 샘플을 분석했습니다.DLS는 위의 네 샘플에 대해 정확한 피크 비트를 측정할 수 없으며 단일 피크만 얻을 수 있으며 RPS 이론에 기반한 NanoCoulter단일 입자 검사 수단을 통해 혼합물의 입경을 성공적으로 측정하고 정확한 봉위를 얻어냈다이어 저자는 RPS의 입경 측정 효과를 추가로 검증해 농도비가 1: 1: 1인 80nm, 120nm, 160nm와 200nm인 혼합물을 만들었다.측정 결과재차 실증하다RPS는 혼합물을 대응하는 봉우리를 순조롭게 측정할수 있으며 부동한 견본봉간의 구분이 뚜렷하고 해상도가 량호하다.이런 사분포 샘플은 실제 샘플을 더욱 진실하게 대표할 수 있다.

마지막으로 저자는 두 종류의 외비체(각각 HEK293 세포와 건강에서 유래)를 골라 각각 NTA, DLS, RPS 기술을 이용해 입경 분석을 한다.그 결과 입경 분석에서 NTA는 TEM과 비슷한 데이터를 얻었지만 DLS는 입경 값이 크고 RPS는 입경 결과가 작은 것으로 나타났다.농도 면에서 RPS는 RPS의 단일 입자 검사 기술 덕분에 각 입자에 대한 정확한 표징을 구현 할 수있는 더 정확한 정량 분석 능력을 보여줍니다.

실제 샘플에 대한 측정을 통해 저자는 네 가지 서로 다른 입자 표징 방법의 특징을 귀납적으로 정리했다(표1).저자는NTA는 입자 입경 분석에 있어서 2-3가지 모태의 샘플을 구분할 수 있는 해상도와 높은 정확성을 가지고 있지만, 외비체류의 샘플에 대해 NTA는 외비체, 낭포, 지단백질을 구분할 수 없으며, 동시에 NTA는 서로 다른 출처의 외비체를 구분할 수 없다.DLS에 대해 저자는 이 방법이 매우 간편하고 미량 샘플로 측정을 완료할 수 있다고 생각하지만, 이 방법으로 측정된 입경 값은 실제 상황에 비해 편차가 크며, 이 방법으로는 샘플의 입자 농도를 측정할 수 없다.TEM 방법은 샘플 입자의 시각적 측정을 직접 구현할 수 있지만 비용이 많이 들고 시간과 노력이 많이 듭니다.RPS에 대해 저자는 이 방법이 입자의 실제 입경 (특히 알 수 없는 샘플의 입자 특징의 경우) 을 직접 측정 할 수 있으며 다중 모드의 혼합 샘플에 좋은 해상도를 가지고 있다고 생각합니다.

표 1.네 가지 서로 다른 입경 분석 방법의 특징을 종합하다.

이 작업을 통해 저자는 농도, 계측 임계값, 노출도, 펌프 유속 등의 요소가 NTA 성능에 미치는 영향을 체계적으로 평가했으며, 그들은 발견농도에서10⁸~10⁹, 펌프 유속이 50AU일 때 입자 샘플에 대해 비교적 정확한 표징 결과를 얻을 수 있다동시에 그들도 제기했다계기 임계값 및 노출도 이 두 매개 변수에 대해서는 샘플의 입경 구체적인 문제를 결합하여 구체적으로 분석해야 한다. 동시에 그들은 또한NTA는 다분산 샘플에 대한 분석 능력이 좋지 않은 반면 RPS는 3봉 또는 4봉 샘플을 성공적으로 구분할 수 있어 RPS가 다분산 샘플에 대해 더욱 우수한 구분 능력을 가지고 있음을 보여준다.이와 동시에 저자는 여러가지 표징수단을 선택하여 두가지 외비체를 분석하였는데 각 표징수단이 얻은 립경과 농도가 같지 않았기에 저자는 다음과 같이 인정하였다.생물학 과립 연구를 진행할 때, 정교 방법학을 운용하여 과립에 대해 다중 표징을 진행해야 한다.。

참고문헌