EV의 수량 추정, EV의 존재 확인 및 EV 제조에서 비EV 그룹의 점유율과 영향 평가 등은 EV에 대한 표징이 필요하다.EV의 표징은 소립경, 치수 이질성 및 분자 이질성, 범용 EV 식별 방법 부족 및 많은 측정 기술의 비 EV 특이성에 대한 도전에 직면 해 있습니다.모든 EV 표상의 요구 사항을 충족하는 측정 또는 방법이 없으므로 직교 방법 (즉, 동일한 측정 제한이 없는 방법) 을 사용하여 상호 검증하는 것이 좋습니다.즉, EV의 표징 매개변수는 핵심 질량 특성 (CQA) 으로서 동일한 지표를 감지하는 두 가지 또는 두 가지 이상의 다른 원리의 방법을 권장합니다.
EV의 전체 구성 (단백질, 지질, 핵산 및 기타 생물 분자 등의 함량 및 비율) 은 EV 공급원에 따라 다릅니다.이러한 개별 분자 카테고리의 측정은 EV의 풍도를 추정하는 데 사용될 수 있지만, 이러한 값이 반드시 EV 농도와 모두 관련이 있는 것은 아니며, 원재료 사이에도 보편성이 존재하지 않는다;그러므로,EV 농도 측정 기준에는 적용되지 않습니다.모든 EV를 계량화할 수 있는 단일 분자의 검사가 없듯이 EV나 EV 아형의 범용 분자 표시도 없다.소스 특이성 및 유형 특이성의 증거에 따라 특정 태그를 선택해야 합니다.현재,아직 알려지지 않은 범용 태그는 출처에 관계없이 모든 EV를 식별할 수 있습니다.이른바 외비체에 대해 이런 표기의 보편성은 아직 명확하지 않거나 접수되지 않았다.4차례 피막간 단백질 CD9, CD63, CD81과 관련된 친화력 기반 방안은 EV 아형인 외비체에 특이성이 없다는 점에 유의하십시오.이러한 네 차례의 필름 간 단백질 중 어느 하나를 겨냥한 항체 부집을 사용하는 EV 집단은 모든 분자 구성을 전면적으로 커버하지 않을 수 없다.또한 모든 EVs가 이러한 단백질 표지물을 표현하는 것은 아니기 때문에 4 차 피막 간 단백질 부집은 모든 EVs를 캡처 할 수 없습니다.동일한 표징 매개변수의 직교 측정 방법(한 가지 원리가 아닌 방법)같은 편차가 있을 것 같지 않습니다.예를 들어, 동시에 EV의 지름을 광학 방법과 비광학 방법으로 각각 유도하고 감지합니다.직교 방법을 사용하여 EV 샘플을 표징하는 것은 공분리물이 생물 표지물이나 기능 발견과 무관하다는 것을 증명하는 데도 매우 중요하다.많은 EV 표징 방법이 EV에 특정하게 적용되지 않거나 모든 EV를 감지할 수 없기 때문에 방법과 결과를 투명하게 공개하여 EV 데이터의 중복성을 확보해야 한다.
EV의 양은 볼륨 측정과 함께 널리 보도되고 사용되는 지표인 particles/mL 단위로 수의 농도를 정의합니다.그러나 많은 기술이 EV에 대한 특이성과 모든 EV에 대한 민감성이 부족하기 때문에 일반적으로 신뢰할 수 없습니다.ISEV의 엄격하고 표준화된 EV 참조 자료 작업 그룹은 최근 측정 기술의 고려 사항과 이 분야가 추적 측정, 개발 및 보고 가능한 좋은 표징의 EV 참조 재료에 직면한 도전에 대해 개괄적으로 설명했다.이 작업의 핵심 하이라이트는 감도 제한에 관계없이 다른 사람들이 결과를 검증 할 수 있도록 검사 방법의 LOD를 공개해야한다는 것입니다.직교 방법을 사용함으로써 EV 농도 측정의 신뢰도를 높일 수 있다，각 방법에는 광 산란 강도 측정과 같은 확실한 LOD가 있습니다.(예: NTA), 형광 강도(예: FCM)및 물리적 크기(예: RPS)직교 방법에는 동일한 측정 제한이 없기 때문입니다.. 예를 들어, 저항 펄스 감지(RPS) 기술은 입경으로 LOD를 나타낼 수 있습니다.유동식 세포술 등 광학 기술의 경우 LOD는 광산란 광학 모델에서 유래한 지름이나 형광 강도에서 유래한 등효가용성 형광단(MESF) 분자로 보고할 수 있다.이러한 방법은 서로 다른 측정 기구와 민감도 사이에서 일치하는 데이터를 생성할 수 있다.입자 검출에 관련된 변수가 많기 때문에나노입자추적분석(NTA), 동적광산란(DLS)을 위한 방법은 아직 없다)또는 영상 스트리밍 세포술은 추적 가능한 LOD를 도출한다。EV와 다른 잠재적 공분리물이나 오염물질을 구분할 수 없는 기술의 경우 상류 분리 절차와 관계없이 농도 보고서를'EV 농도'가 아닌'미세먼지 농도 또는 EP 농도'로 표시하는 것이 권장된다.
EV 크기 (나노 반지름 또는 지름 단위) 측정은 구형 또는 이동률과 같은 가정에 의존하며 업스트림 변수에 의해 출력 결과가 영향을 받을 수 있습니다.유동식 세포술,NTA、RPS、다각도 광 산란 및 동적 광 산란 (DLS) 은 EV가 구형이라고 가정합니다.크기와 지름은 측정 방법 간에 자주 사용되지만 이러한 유도 방식은 측정 기술 간의 일관된 차이를 초래할 수도 있습니다.예를 들어,NTA나 DLS와 같은 입자 브라운 움직임에 의존하는 기술은 유체 역학적 지름을 측정하며 냉동 선글라스와 같은 이미징 방법에 비해 입자 크기를 과도하게 추정할 수 있습니다.EV 전체 가능한 지름 범위 (수십 나노미터에서 마이크로미터까지) 에서 EV 크기를 정확하게 측정할 수 있는 방법은 거의 없다.예를 들어, 고해상도 이미징을 냉동하는 것이 가장 정확한 방법 중 하나이지만, 검사 통량이 상대적으로 낮고, 많은 큰 EV는 종종 수량이 적어 계량화할 수 없을 수 있습니다.정량이 100nm 이하인 저명암비 EV의 능력도 제한 요인일 수 있다.
점점 더 많은 연구자들이 민감도가 높은 전용 단일 입자 분석 기술을 사용함에 따라, 많은 EV 제제가 대부분의 EV 지름이 <100 nm인 대수 정적 분포와 같은 비대칭적인 오른쪽 편향 분포를 나타낸다는 것을 점점 더 잘 알고 있습니다.대부분의 단일 입자 분석 기술은 모든 EV 그룹을 분석 할 수 없기 때문에연구자들은 감지된 EV 지름 분포를 공유해야 한다，평균 크기, 중앙 크기 또는 중위 값 크기 등의 요약 지표뿐만 아니라이러한 지표는 LOD 및 비대칭 크기 분포로 인해 쉽게 기울어집니다.주의하십시오.NTA를 통해 낮은 굴절률 입자를 측정하는 등 크기 통계를 맞추면 EV 그룹의 실제 아날로그 지름이 아니라 기기의 LOD에 더 가까울 수 있습니다.독점 알고리즘이 있는 소프트웨어를 사용하여 입경을 결정하는 기술도 소프트웨어 버전이나 소프트웨어 플랫폼 간의 차이를 초래할 수 있으므로 소프트웨어와 그 버전도 제공해야 한다.굴절률 가정에서 크기를 유도하는 기술은 서로 다른 샘플 성분과 적재물로 인해 변화를 초래할 수 있다. 필름 내장 염료와 같은 형광 프로브에서 유도되는 크기는 서로 다른 필름 지방 성분에 기반한 서로 다른 염료 내장으로 인해 변경될 수 있습니다.EV와 공분리물/오염물질을 구분할 수 없는 기술의 경우 업스트림 분리 단계와 관계없이 지름 보고서를'EV 지름'이 아닌'알갱이'또는'EP'지름으로 표현하는 것이 좋습니다.
EV 검사 실험과 기기의 사용과 전문가 지식의 확대에 따라 관련 표징 보고서 척도의 확정도 데이터의 신뢰성과 중복성을 확보하기 위해 계속 증가하고 있다.MISEV2023 설명서에는 최소 실험 및 장비별 보고서에 대한 주의 사항 목록이 자세히 나와 있습니다.이러한 작업은 실험 설계와 관계없이 일반적으로 적용됩니다.여기에 나열된 기술은 상세하지 않으며 많은 검사 기술이 개발 중이거나 적극적으로 연구 중입니다.그러나 나열된 기술은 모두 상업적으로 얻을 수 있으며 여러 연구자들의 발표 문헌이 있다.(편폭의 제한으로 인해 필자는 여기서 현재 자주 사용하는 몇 가지 EV 입경과 농도 표징 도구에 대한 설명과 그 주요 관점만 열거한다.)ISEV는 대조군에는 검사항체로서의 동형항체 또는 동형우연의 포획미주와 검사항체만 함유된 포획미주 (항체가방피의 포획진주) 가 포함되여야 한다고 건의했다.여러 EV 샘플 농도를 사용하여 신호의 적정을 보여야 합니다.마이크로비즈를 제조할 경우 그 시약과 화학성분을 공포해야 한다.상업포획 마이크로볼 시약의 목록과 로트 번호도 공포해야 한다;표준화된 마이크로볼의 중위 형광 강도 값을 발표한다.단태권정 마이크로볼에서 나온 등효가용성형광단 (MESF) 분자의 데이터와 중위형광강도값 통계 (단EV류식세포술과 같음) 를 발표한다.완전하고 상세한 방법학을 공포해야 한다.2023년에는 국제세포외낭포학회(ISEV), 국제세포계수진보학회, 국제혈전·지혈학회로 구성된 3학회 실무그룹(EV 유동식 세포술 실무그룹) 이니셔티브를 거쳐'단일 EV 유동식 세포술 요강'을 발간해 단일 EV 유동식 세포술 검사 개발을 위한 주의사항을 포괄적으로 해결했다.샘플 부피, 형광 및 광 산란 매개변수의 교정은 단일 EV 스트리밍 결과의 해석과 복제에 매우 중요합니다.단일 EV 스트리밍 세포계를 사용하여 입자 농도를 보고하는 경우 LOD의 상한선과 하한선을 결정하여 직교 방법 또는 다른 사람이 결과를 반복하고 검증할 수 있도록 합니다.현재 이미징 세포계는 동적 트리거 방법을 사용하는데, 이는 낮은 LOD의 확정을 정의하기 어렵기 때문에 표준화하기 어렵다.DLS，광자 관련 스펙트럼(PCS)과 준탄성광산란(QELS)이라고도 하며, 희석 수용액 분산체 중 충분히 단일 분산된 입자의 유체동력학적 지름을 확인할 수 있는 기술이다.DLS는 용액의 여러 입자가 산란하는 레이저 강도의 자체 관련 함수를 측정합니다.관련 함수로부터 입자 확산 계수에 대한 정보를 가지고 있으며, 이 정보는 스톡스-아인슈타인 브라운 운동 이론을 통해 유체 동력학 직경과 관련이 있다.다양한 알고리즘을 사용하여 측정된 상관 관계 함수에서 확산 계수를 내보낼 수 있습니다.가장 일반적인 방법은 누적량 분석이지만그것은 샘플이 모두 단일 분산된 크기 분포라고 가정하는데, EV 샘플은 이런 분포를 갖추지 못했다. EV 샘플의 다분산 크기 분포에 대해 확산된 유도 관련 함수의 계수 분포는 불편한 수학 문제가 된다.이것은DLS는 EV 샘플의 정량 속성을 결정하는 데 사용되지 않습니다.DLS가 EV의 단일 분산 크기 중 일부에 적용되지 않는 한한편, DLS는 EV 시료에 있을 수 있는 마이크로미터 입자와 가능한 집합체의 존재를 정성적으로 확인하는 데 사용될 수 있다.다양한 전자 현미경 (EM) 은 EV (크기에 상관없이) 를 감지 할 수있는 소수의 기술 중 하나입니다.그러나 선글라스의 통량은 더 작은 EVs에 비해 더 큰 EVs가 통계적으로 과소평가된다는 것을 의미한다.SEM, TEM 및 Cryo-EM은 서로 전환하거나 비교 가능한 품질의 이미지를 제공할 필요가 없는 고해상도 EV 표징 방법입니다.예를 들어,Cryo-EM은 지질 이중 구조를 명확하게 표시할 수 있으며, 샘플을 고정하기 위한 TEM의 탈수 조건보다 EV 형태를 더 잘 유지하고 정량(크기)을 더 정확하게 할 수 있습니다.적재망 표면에 붙어 있는 입자뿐만 아니라 일정한 부피의 모든 입자가 이미지를 만들 수 있기 때문이다.낮은 보고 요구 사항을 결정하기 위해 EM 접근 방식에 대한 표준화 연구는 매우 제한적입니다.TEM의 경우 고정, 흡착 및 음수 염색법의 세 가지 주요 매개변수를 공개해야 합니다.고정에는 사용된 고정제 및 그 농도와 부화시간이 포함된다.흡착은 적재망 재료, 적재망 사이즈, 박막 유형, 코팅, 부화 시간과 세척 디테일을 포함한다;음염색의 상세한 정보는 바탕물, 농도와 부화시간을 포함해야 한다.또한 저배율 및 고배율 이미지와 이미지 선택 기준을 발표해야 합니다.NTA，또한 입자 크기와 농도를 추정하기 위해 EV 분야에서 널리 사용되는 광학 기술의 단일 입자 추적으로 간주됩니다.NTA는 일반적으로 입자의 확산 계수를 측정해 유체 역학적 지름을 도출하는 지름 분포 변화를 줄이는 알고리즘을 사용한다.주목할 만한 것은,일부 NTA 장치에 사용되는 FTLA 알고리즘은 단일 분산 혼합물을 더 잘 나타내기 위해 개발된 반면 EV는 그렇지 않아 인위적인 다양한 의합 분포를 초래할 수 있다. 그리고 현재 NTA 설정의 LOD를 확인하거나 공개할 방법이 없습니다.많은 학자들은 이미 몇 가지 표준화 연구를 진행하여 사용자와 기기 사이의 결과를 비교하였다.NTA를 사용하여 복잡한 생체 유체 샘플의 지름 분포 및 농도를 측정하려면 신중하게 해석해야합니다.지단백과 대단백 복합체 등 공분리물을 계수하고NTA는 직경이 수백 나노미터 이상인 EV를 계량화하기 어렵다。NTA의 공개 정보에는 기기 모델, 카메라 유형, 카메라 설정, 레이저 파장, 레이저 전력, 소프트웨어 버전, 분석 설정 및 프레임당 입자가 포함되어야 합니다.이미 알고 있는 경우사용하는 알고리즘에 따라 다른 결과가 발생할 수 있으므로 지름 분포를 생성하는 알고리즘을 공개해야 합니다.빛 산란이나 형광 감지 모드의 경우 공백 완충액을 대조로 사용하는 것이 좋습니다.형광 NTA의 경우 광 산란 모드의 총 입자 수와 형광 모드의 표시 입자 수, 표시 제거 방법 및 완충액/시약 제어를 보고하여 표시의 위장 색상을 평가합니다.유체 샘플링 기기를 사용하는 경우에도 설정을 게시해야 합니다.。MISEV가 저항펄스 감지(RPS) 기술을 유동식 기반 방법(마이크로비즈 기반 유동식 및 단일 EV 유동식 포함)과 현미경 기반 방법(원자력 현미경, 전경, DLS, NTA, 초분별 현미경 등 포함)과 함께 추천하는 상용 EV 입자 표징 방법으로 채택한 것은 이번이 처음이다.몇 안 되는 비광학 원리의 EV 표징 기술 중 하나이기도 하다.RPS는 쿠르트의 원리를 이용하여 입자의 농도와 직경을 확정하고, 일부 설비는 zeta 전위 기능도 갖추고 있다.현재 RPS의 지름 LOD는 50nm로 낮다. 문헌에 따르면RPS는측정 결과는TEM은데이터의 일관성이 매우 높습니다.RPS 데이터를 보고할 때는 기기 모델, 구멍 지름, 미세 구슬 지름 및 출처 교정 및 소프트웨어 버전을 공개하는 것이 좋습니다.앞서 언급했듯이 (입자 크기의 정량) EV 데이터의 경우단일 지름 통계가 아닌 RPS의 지름 분포를 공개하는 것이 좋습니다.그리고 공백 완충액을 대조하여 배경을 식별하는 것이 좋습니다.및 동일한 농도의 오염물 제거제가 분해된 샘플은 표시 사건을 확인합니다.RPS 기술은 큰 입자에 쉽게 막히기 때문에 원심분리나 여과 등 분석 전 단계를 이용해 큰 입자를 제거할 수 있다.이러한 방법은 분석 중인 EV 그룹을 변경하고 직교 방법과의 비교에 영향을 줄 수 있으므로 분석 전 처리 절차를 명확하게 설명해야 합니다.단백질 부집과 정량에 대한 상세한 정보를 제공해야 한다.가능하다면 항원의 양성과 음성 대조를 포함해야 한다.단백질이 EV와 관련이 있다고 주장하면 EV 제제의 순도 측정을 포함해야 한다.표준화된 샘플, 겔 전기 수영, 필름 변환 방법, 프로브 및 이미징/분석의 모든 상세 정보 (항체 정보, 샘플 변성 및 환원 조건, 필름 변환 방법, 필름 유형, 완충액 및 이미징 장비 및 매개변수 포함 및 이에 국한되지 않음) 보고;모든 WB의 재단되지 않은 이미지를 제공합니다 (저널에 게시되는 경우 보충 정보로 필요).이 가이드는 위의 각 장에서 EV 표징의 다른 방법에 대해 각각 토론하고 구체적인 조언을 제공했다.어떤 방법을 사용하든 표징의 총체적건의는 다음과 같다.
- 각 EV 제제는 EV 공급원의 정량 측정을 통해 정의되어야 합니다 (예를 들어, 분비 세포의 수, 생체 유체의 부피, 조직의 질량 등).
- EV의 풍도를 추정해야 합니다 (입자 수, 단백질 및/또는 지질 함량 포함).
- EV 제제에 실험 목적에 필요한 특이성에 따라 EV 아형 또는 EV와 관련된 성분이 존재하는지 검사해야 한다.
- 비낭포, 공분리 성분의 존재 정도를 확정하다.
- 정량지표표징EV를 사용할 때는 계측기나 방법의 검사한도(LOD)를 제공해야 한다.
