“

　　다기능 멀티 채널 PurePep Chorus를 사용하여 PNA 작성 조건을 빠르게 최적화

펩타이드 핵산 (PNA) 은 펩타이드 골격을 가진 DNA 유사물이며 다양한 물리 화학 성질을 가지고 있다.PNA의 메인 체인 뼈대는 N (2-아미노에틸)-글리신과 핵산 염기가 메틸 카르보닐기를 통해 연결되어 있습니다.

그림 1: 펩타이드 핵산의 구조 설명도 및 DNA와 결합

펩타이드 핵산 비이온 핵산 유사물은 PNA에 음전하가 없기 때문에 DNA와 RNA 사이에 정전기 척력이 존재하지 않기 때문에 결합의 안정성과 특이성이 크게 향상되었다. DNA나 RNA 분자와의 교잡 능력은 DNA/DNA 또는 DNA/RNA보다 훨씬 우수하다. 매우 높은 교잡 안정성, 우수한 특이 서열 식별 능력, 비핵산 효소와 프로테아제에 나타난다.

PNAs는 RNAs 결합을 통해 상호 보완하여 유전자 발현을 억제할 수 있다.또한 특정한 조건에서 사슬침입메커니즘과 DNA이중사슬서렬의 결합을 통해 유전자표현을 촉진할수도 있다.이상의 장점을 바탕으로 최근 10년 동안 PNA는 여러 분야에 널리 사용되었고, 높은 친화력과 특이성으로 인해 치료제뿐만 아니라 진단의 응용에서도 강력한 도구가 되었다.

PNA의 기초 연구가 깊어지고 새로운 기술이 등장함에 따라 PNA는 더 나은 성능과 더 넓은 응용 전망을 보여줄 것이다.

　　당면 과제

PNAs의 합성은 합성 과정에서 중합이 발생하기 쉽고 보호되지 않는 과정에서 많은 부반응이 있기 때문에 비교적 큰 도전을 가지고 있다.중합이 쉬운 문제에 대한 일반적인 전략은 축합 반응에 과도한 시약을 사용하는 것입니다.그러나 합성용 N단 보호용 PNA 단일 시약은 가격이 상대적으로 높아 널리 활용되지 않고 있다.따라서 PNAs의 성공적인 사업화를 돕기 위해 상대적으로 비용 효율적인 합성 공정을 개발해야 합니다.

　　PurePep Chorus에서 합성 조건 최적화

이 문서에서는 PurePep Chorus 자동 합성기에서 PNA의 합성 조건을 빠르게 최적화하는 것을 보여줍니다.

PNA 1은 PNA 단일체의 과량 계수, 반응 시간 및 온도와 같은 다양한 합성 매개변수를 조사하기 위해 시퀀스를 참조하는 데 사용됩니다.PNA 1의 순도가 가장 높은 조건을 합성하면 다른 5개의 길이 및 퓨린(아데노퓨린 및 구아닌) 함량이 다른 서열을 합성하는 데 사용됩니다 (표 1 참조).순도는 합성을 고찰하는 관건적인 요소로서 PNA 단일체의 공간위치저항이 크므로 축합반응이 불완전하여 저순도를 초래하기 쉽다.

표 1: 이번 사례에 언급된 PNA 시퀀스 정보

PNA 1은 PurePep Chorus 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성되었으며 합성 당량은 25 μmol이며 대체도가 0.27 mmol/g인 Rink Amide MBHA 수지를 사용하고 Fmoc/tBu 직교 보호 체계를 따릅니다.수지상 Fmoc 기단의 탈보호는 20% 페니딘 DMF 용액을 사용해 실온에서 5분 ×2회 반응한다.축합 반응은 HCTU와 NMM의 체계를 사용하며, 구체적인 반응 세부 사항은 표 2를 참조한다.축합 반응이 끝난 후 봉인 작업을 수행하고 10% 아세트산무수 DMF 용액을 사용하여 실온에서 5분 동안 반응한다.마지막 단계의 보호가 끝나면 수지를 절단액(TFA: TIS: H2O=95: 2.5: 2.5)에 넣고 실온에서 4시간 동안 반응한다.

이상의 조작은 Chorus에서 필요한 조건에 따라 소프트웨어에 서로 다른 Protocol을 설치할 수 있으며, 소프트웨어는 자동으로 필요한 시약량을 계산하고, 기기는 자동으로 작동하며, 인공 조작을 더욱 크게 절약할 수 있으며, 시험 방안이 엄격히 실행되도록 보장한다.

표 2 축합 조건에 대한 연구

표 2의 데이터 분석을 통해 PNA의 반응 당량 수가 10배일 때 산물 조제품의 순도가 81% 에 달한다는 것을 알 수 있다.그러나 합성 원료인 Fmoc-PNA 단일 가격이 높기 때문에 위의 설계는 쉽게 받아들여지지 않는다.PNA의 반응 당량 계수를 4배로, 생산물 조제품의 순도를 72%로 낮춘다.이때 PNA의 반응당량계수를 4배로 유지하여 반응온도를 45 ℃ 로 높이고 축합시간을 5분으로 줄이면 산물조제품의 순도는 61% 로 더욱 떨어진다.이로부터 알수 있는바 축합반응에 있어서 5분간의 반응시간이 너무 짧다.이때 다른 조건은 변하지 않고 단독으로 반응시간을 10분(실험D)으로 늘리면 굵은 펩타이드 순도가 82%로 실험A의 결과와 비슷하다.실험E는 반응의 조건을 한층 더 고찰하는데 사용되였는데 반응당량계수를 2로 조정하고 2차례의 가양반응을 하였다.총량이 같은 반응원료를 사용하고 같은 축합시간하에서 산물조제품의 순도를 5% 제고시켰다.

PNA 1 결과물의 순도 최대치를 기준으로 작성 조건을 결정했으며 나머지 시퀀스는 PNA 1과 같은 방식으로 작성됩니다 (예: 메소드 E). 결과는 표 3에 나와 있습니다.

표 3: 방법 E를 사용하여 나머지 5개 PNA에 대한 황삭 결과 작성

위의 5 개의 PNA 합성 후 산물의 조제품 순도는 66-91% 이며, 이러한 결과는 펩타이드 핵산에 만족합니다.흥미롭게도 퓨린 함량이 더 높은 PNA 산물은 더 높은 순도를 가지고 있다.

그림 2: 210nm 파장에서 UPLC-UV 시스템으로 채집된 PNAs 산물 5개의 크로마토그래프.UPLC 시스템은 Waters H-class UPLC/ESI-MS이며 크로마토그래피 기둥은 C18(1.7μm, 2.1x50mm)이다.흐름상 0.1% TFA 물 (A) 과 아크릴 (B) 혼합 용액.

　　요약

이 응용 프로그램에서는 PurePep Chorus 시스템을 사용하여 PNA 합성을 최적화하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.처음에 우리는 10배의 반응당량의 PNA를 사용하여 실온에서 1시간 동안 축합반응하였는데 이런 방법은 순도가 81% 에 달하는 산물조제품을 얻을수 있다.우리는 반응물의 사용량을 낮추고 조제품의 순도에 대한 영향을 최소화하여 이 반응이 더욱 경제적이고 지속가능하며 록색화학의 요구에 더욱 부합되도록 하는데 진력하고있다.결국 우리는 반응물의 사용량을 줄이면서도 순도를 높이는 방법을 개발했다.2회 축합 방식을 사용하여 샘플링마다 2배의 반응 당량을 사용하여 45 ℃ 조건에서 5분 동안 반응하면 PNA 1의 조제품 순도를 81% 에서 87% 로 높일 수 있다.마지막으로 이 메서드는 다른 5개의 PNA 작성에 두 배로 적용됩니다.

길이와 퓨린 함량이 다른 펩타이드 핵산에 대해 이 방법은 모두 좋은 산물을 얻을 수 있다.PurePep Chorus 폴리펩티드 합성기는 합성 방안이 필요에 따라 유연하게 조정될 수 있기 때문에 이 작업에 좋은 도구입니다.예를 들어 반응 당량 계수, 중복 횟수, 온도 및 시간을 수정한다.이와 동시에 자동화된 계기 및 소프트웨어의 자동계산기능은 인공조작을 줄이고 실수위험을 낮추는데 도움을 주며 최적화후의 합성조건은 기타 PNAs 합성에 쉽게 응용될수 있다.