백신의 개발은 연구 개발에서 초기 임상 전 연구, 상업화 생산, 검측 및 배치 통과에 이르기까지 백신 제품의 유효성과 안전성을 보장하기 위해 대량의 분석과 검측과 관련된다.백신 개발 과정 중의 생물 분석은 샘플 기질, 분석물 유형 및 작업 흐름 효율 등 방면의 도전에 직면하고 있다. 예를 들어 분석에 사용되는 백신 샘플의 차이가 매우 크고 분석물의 범위가 매우 넓다. 다당, 단백질, 폴리펩타이드 등을 포함한다. 이런 것들은 모두 반드시 다른 기질에서 검사를 해야 한다.이밖에 신세대 백신은 갈수록 많은 항원과 관련되는데 례를 들면 HPV (인유두종바이러스) 백신은 2가, 4가, 9가 등 여러가지 류형이 있는데 이는 또 검사의 복잡성을 크게 증가시켰다.면역분석법은 일반적으로 백신의 적도, 순도와 효력, 동물과 인체에서의 그들의 면역원성반응 등을 측정하는데 사용되는데 다공판을 기반으로 한 ELISA 면역분석은 이미 백신생물분석에서의 황금표준기술의 하나로 되였다. 여기에는 정량항원표위, 불순물수준을 평가하고 백신개발에서의 적도와 면역원성을 감시하는 등이 포함된다.그러나 갈수록 긴박해지는 프로젝트 일정으로 인해 연구자들은 다음과 같은 백신 면역 분석 성능의 개선을 모색하기 시작했습니다.

백신 후보 분자와 소형 실험 동물의 샘플과 같은 더 적은 양의 진귀한 시약을 사용하십시오.

검사 방법은 혈청과 혈장, 알루미늄 조제와 유유 조제를 함유한 샘플을 편리하게 처리할 수 있다

작업 시간 단축

테스트 방법 개발 시간 단축

Gyrolab® 시스템은 이러한 요구 사항에 대한 해결책을 제공하고 백신 개발에서 많은 추가 혜택을 제공합니다.Gyrolab의 개방형 플랫폼은 다양한 분석물, 샘플 유형 및 조제법에 대한 신속한 검사 개발을 지원하고 다양한 응용프로그램에 즉석형 시약함을 제공합니다.Gyrolab 에 Bioaffy™ 미세 흐름 제어 CD에서 납 업그레이드된 면역 검사를 진행하여 다양한 기질로부터의 간섭을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 샘플과 시약 소모량이 매우 적어 최신 세대 백신과 소형 실험 동물 시험의 수요를 만족시킬 수 있다;다중 분석물을 병렬 분석하는 하이패스 및 자동화 모드를 통해 가동 시간을 크게 단축하고 데이터를 신속하게 제공하여 까다로운 프로젝트 일정과 의사 결정을 신속하게 수행할 수 있습니다.21 CFR Part 11 요구 사항을 충족하는 Gyrolab 소프트웨어 워크스테이션은 개발 된 검사 방법 및 데이터가 규제 환경 요구 사항을 충족하고 제약 공장과 CRO 사이를 원활하게 이전 할 수 있습니다.

　　이 글은 Gyrolab 시스템을 사용하여 백신 개발 성능과 효율성을 향상시킨 몇 가지 응용 사례를 소개하여 실제 사용에서 Gyrolab 시스템의 이점을 설명합니다.

사례 1:1.5시간 동안 혈청 속 항원 특이성 항체 검사

백신을 접종한 피실험자의 기억 B세포(MBC)에서 나오는 항체의 양과 질을 검사하는 것이 종신성 보호항체를 어떻게 유도하는지 파악하는 관건이다.인간 외주혈 항원 특이성 기억 B세포의 상대적 빈도는 일반적으로 연속 유한 희석법(serial limiting dilution assay, sLDA)과 ELISA 분석 세포 배양 상청액을 통해 결정되지만, 이 방법은 시간과 노력이 많이 들고 많은 실험 재료가 소모되기 때문에 노바티스의 백신과 진단 개발 연구진은 ELISA 면역 측정법을 Gyrolab 시스템으로 옮겨 생산량을 높인다.이 연구는 네세스균 항원(Neisseria)을 세 가지 조제와 조합해 생쥐를 접종하고, 면역검사를 통해 생쥐의 기억 B세포에서 나오는 IgG 아형을 확인하는 것을 목표로 한다.연구자들은 두 가지 검사 형식을 테스트했습니다.

　　직접 검사(Direct Assay)

평가에 사용: ① 바이오매스 항원과 Gyrolab Bioaffy 미세 흐름 제어 CD에서 스트렙토마이신 친화 기둥을 결합하여 특이성 IgG를 포획하는 능력;② 세포배양상 맑은 액체에 있는 항원 특이성 항체의 민감도를 측정한다.③ Gyrolab Viewer의 결합곡선을 통해 항체와 특정 항원의 결합 친화력을 평가한다.

　　역방향 체크(Reverse Assay),

Alexa 형광 마커의 항원 감지가 CD 친화 기둥과 결합된 특이성 IgG의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

직접 분석

그림 1. Gyrolab 검사와 ELISA는 네슬식균을 접종한 피실험생쥐의 B세포 배양상 청액에서 같은 양성과 음성 샘플을 감정했다.Y축은 Gyrolab이 검사한 항체 적도이며, ELISA가 감정한 양성 샘플은 녹색 상자로 표시되어 있다.

그림 2. Gyrolab 직접 검사법은 몇 마이크로리터의 샘플에서 서로 다른 IgG 아형에 속하는 항체를 동시에 검사할 수 있다.

ELISA에 비해 Gyrolab 시스템에서 항원 특이성 항체 검사를 하는 것은 여러 가지 장점이 있으며, 몇 마이크로리터의 시료만으로 항체 반응의 질량, 즉 IgG 아형의 상대 수량을 분석할 수 있다.

사례 2:시약 선별 - 방사선 검사를 위한 백신 배치 비교

다가백신의 생물분석은 갈수록 복잡해지고있으며 대량의 검사방법을 개발해야 한다.다가백신은 여러 개의 항원을 포함하기 때문에 각 항원 성분에 대해 방출 검사 방법을 개발하여 용량과 효력을 확보해야 하기 때문에 각 제품의 검사 수량에 항원의 수량을 곱해야 한다.미국 머크사의 백신분석개발팀은 표시된 검사항체 등 다가백신검사방법의 개발과 시약소모를 최소화할수 있는 고도의 신축성있는 Gyrolab검사방법을 개발했다.이 방법은 Gyrolab Bioaffy CD의 스트렙토마이신 친화 기둥에 고정된 바이오매스 염소 항생쥐 IgG를 기반으로 생쥐 알파-PS mAb와 같은 분석물 특이성 포획 항체를 넣은 후 시료를 넣은 다음 두 번째 분석물 특이성 항체(예: 토끼 알파-PS pAb)로 포획된 분석물을 검사하고 마지막으로 Alexa Fluor로® 647에 표시된 당나귀 항토끼 항체는 형광 검사를 한다 (그림 3).이러한 5층의"이중 협심"검사 형식은 특정 분석물에 대한 시약을 표시할 필요가 없으며, 분석물 특이성 시약은 쉽게 대체될 수 있기 때문에 최소한의 개발만으로 다가다당과 다가단백질 백신의 검사 및 항혈청의 로트 간 차이에 응용할 수 있다.

그림 3. 5층 "듀얼 코어" Gyrolab 검사 형식.PS: 다당류 분석물

Gyrolab 검사법은 세 가지 항원 테스트에 대한 두 개의 항혈청 로트를 비교하는 데 사용됩니다.Gyrolab Viewer 소프트웨어 모듈을 사용하면 CD 마이크로 채널의 친화 기둥에 있는 각 데이터 점의 결합 반응을 시각화할 수 있어 데이터가 더 많은 시간이 걸리는 효력 곡선에 필적할 수 있다 (그림 4).

그림 4. Panel A: 형광 강도 데이터 (왼쪽) 와 반응 곡선 (오른쪽) 을 사용하여 원래 A, B, C에 대항하는 항혈청 로트를 비교한다.Panel B: 항원 B의 Gyrolab Viewer는 강도 곡선 이미지와 결합하여 새로운 로트의 기둥에 형광 강도가 낮고 피크 드래그가 증가한다는 것을 보여주며, 이 로트의 항체 친화력이 이전 로트보다 낮다는 것을 나타낸다.

비록 두 로트 대항 원 A의 표현은 비슷하지만, 구 로트 대항 원 B의 표현은 더 좋고, Gyrolab Viewer에서 스펙트럼을 결합한 피크 면적은 더 크며, 적정 시 노이즈 비율은 더 높다.새로운 로트는 뚜렷한 기둥의 형광꼬리를 보여주었는데 이는 항원과의 친화력이 비교적 낮다는것을 보여준다.항원 C에 대해 두 차례의 항혈청은 모두 뚜렷한 꼬리질현상을 보이고있으며 낡은 차례의 항혈청은 더욱 많은 봉예미를 보이고있다.적정할 때 낡은 차수의 배경이 비교적 높고 신호음이 비교적 낮다.따라서 Gyrolab Viewer의 시각적 결합 스펙트럼, 반응 곡선 및 노이즈 비율의 결합은 항혈청 로트를 이해하는 데 귀중한 의견을 제공합니다.

머크의 팀은 Gyrolab 시스템이 다공판 기반 검사 데이터와 일치하는 가치 있는 통계 및 그래픽 데이터를 제공하며, 빠른 회전 시간, 높은 통화량 및 시각화 결합 강도 능력 등 추가 이득을 얻을 수 있다는 결론을 내렸다.

사례 3:항원 적도 정량 동적 범위 4logs로 확대

백신 개발사들은 알루미늄 좌제에 흡착된 당단백질 항원을 측정하기 위해 면역 측정의 동적 범위를 확대해야 한다.연구진은 ELISA를 Gyrolab 시스템으로 옮겨 동적 범위를 5-300mIU/mL에서 ~0.6-40 000mIU/mL로 확장했고, Gyrolab 검사는 정량의 상한선과 하한선을 동시에 확장했다.

그림 5. Gyrolab은 항원 적도를 측정할 때 동적 범위를 크게 확장하는 강력한 감지 방법을 제공합니다.

사례 4:조제 개발을 지원하는 백신 효력 시험

차수 간 효력의 일치성을 평가하는 것은 백신 품질 통제의 중요한 구성 부분이다.효력시험은 안정성 연구, 발효 및 순화 공정의 검증과 최적화, 신구 시설 시설 비교 및 조제 또는 조제 변경의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있다.

미국 머크사는 쥐의 효력 시험에서 Gyrolab 시스템과 Luminex 검사법의 성과를 비교했다.이 연구는 생쥐의 체내 면역과 관련돼 정상화된 항원 시료를 6~12개 용량 농도 범위로 희석했다.유효 복용량 (ED50) 은 각 투여 그룹의 50% 의 쥐 혈청 전환의 최대 복용량에 따라 결정되며, ED50 수치를 얻으려면 최대 220 개의 쥐 혈청 샘플이 필요하기 때문에이 번거로운 작업에는 많은 양의 샘플이 필요합니다.Gyrolab 검사는 Luminex 측정 (R2 = 0.97) 에 필적하는 감도와 재현성 (CV<10%) 으로 신뢰성과 안정성이 입증되었지만 작동 시간이 더 짧고 회전 시간이 더 빠릅니다.

그림 6. Gyrolab 테스트는 반복성이 높습니다.CV<10%

그림 7. Gyrolab과 Luminex의 면역 검사에서 나온 결과는 비교 가능성이 있다