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개요
고통량 단백질 안정성 분석에서의 차시 스캔 형광법(Differential Scanning Fluorimetry·DSF)은 단백질 열변성 과정에 기반한 형광 검출 방법이다.DSF(내원 형광법)는 측정 시료에 대해 어떠한 표시도 할 필요가 없고, 어떠한 형광 프로브도 사용할 필요가 없으며, 전체 시료 마이크로 공판을 빠르게 측정할 수 있으며, 시료 후보물과 조제 성분의 선별을 돕기 위해 높은 통량의 데이터를 제공한다.
제품 정보
고통량 단백질 안정성 분석에서의 차시 스캔 형광법(Differential Scanning Fluorimetry·DSF)은 단백질 열변성 과정에 기반한 형광 검출 방법이다.
단백질 안정성
단백질 안정성은 생물 기술 약물의 중요한 핵심 품질 속성 중 하나이며, 생물 약물의 약효, 생산 타당성, 안전성 및 유통 기한을 결정한다.단백질의 고급 구조 안정성은 단백질이 선반 수명 기간 동안 활성 및 안전을 유지할 수 있도록 보장합니다.
안정성 연구는 온도, pH 값, 부자재 성분 및 저장 시간 등과 같은 다양한 조건에서 고급 구조 HOS (High Order Structure) 의 단백질의 안정성을 확인하여 적절한 저장 및 운송 조건을 결정하는 데 사용됩니다.이와 동시에 FDA, EMA 등 감독관리기구도 생물약사용승인을 수권하기전에 광범한 안정성수치를 요구하였다.그러므로 치료성단백질약물의 고급구조안정성을 리해하고 확보하는것은 생물제약기업이 안전하고 효과적인 약물을 개발하는데 필요한 조건이며 연구일군은 연구개발과 생산의 여러 단계에서 단백질고급구조안정성을 분석하고 평가해야 한다.
단백질 안정성에 대한 일반적인 분석 방법
단백질의 안정성 분석은 일반적으로 다음과 같은 방법을 사용하여 연구됩니다.
생화학적 방법
원 2 크로마토그래피(CD, Circular Dichroism Spectroscopy)
차시 주사량 열법(DSC)
정량 PCR(qPCR) 기술(외원 형광 DSF)
동적 광 산란(DLS) 및 정적 광 산란(SLS) 방법
차시 주사량 열법 (DSC) 법은 종종 단백질 안정성 분석의 가장 중요한 솔루션으로 사용되지만, 96 또는 384 공판과 같은 마이크로 공판 (예: 96 또는 384 공판) 에 저장된 많은 샘플에 대한 빠른 분석 요구로 인해 약물 선별 및 초기 개발에서 DSC의 적용이 제한됩니다.따라서 DSF (내원 형광법) 는 유행하고 비용 효율적인 솔루션이 되었다.
DSF(내원 형광법)는 측정 시료에 대해 어떠한 표시도 할 필요가 없고, 어떠한 형광 프로브도 사용할 필요가 없으며, 전체 시료 마이크로 공판을 빠르게 측정할 수 있으며, 시료 후보물과 조제 성분의 선별을 돕기 위해 높은 통량의 데이터를 제공한다.
DSF 법은 대량의 샘플을 빠르게 선별하여 약물 선별, 성약성 분석의 효율을 크게 향상시켰으며, 분석 결과는 DSC 기술과 서로 정교하게 검증되었다.많은 바이오기술 약물의 경우, DSF 방법을 이용하여 빠른 대량 선별을 위해 DSC 기술을 사용하여 DSF의 조기 선별 결과를 정교하게 검증하는 것은 약물 선별과 약물 개발의 효과적인 방안이다.
DSF는 다음을 포함하되 이에 국한되지 않는 단백질 안정성 분석 분야에서 광범위하게 활용됩니다.
단백질 열 안정성 검사: 대부분의 단백질은 온도에 대한 엄격한 요구 사항을 가지고 있으며 단백질 열 안정성에 대한 평가는 단백질 기능의 정상적인 발현에 도움이됩니다.DSF는 단백질의 열 안정 파라미터를 높은 통량으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라 돌연변이,pH、이온의 강도 등 요소가 열 안정성에 미치는 영향은 그 중에서 열 안정성을 높일 수 있는 요소를 선별한다.
단백질 안정제, 억제제의 높은 통량 선별: 화합물 배합체 라이브러리에 대한 높은 통량 선별을 통해 단백질 샘플과 결합된 후보 화합물을 획득하고, 화합물이 단백질 안정성에 미치는 영향을 평가함으로써 단백질 안정제, 억제제, 보조 인자 및 분자 반려자를 선별한다.
단백질 작용 메커니즘 연구: 예를 들어 단백질-단백질 상호작용 연구, 새로운 발견 단백질 약물의 친화 동력학 분석, 단백질과 배합체, 보조인자, 분자 반려자가 결합된 열 안정성 파라미터 테스트.
소분자 화합물 억제 메커니즘 연구: DSF를 이용하여 높은 통량, 매트릭스식의 다양한 화합물 검사 (화합물과 일부 알려진 억제제, 바탕물, 산물 또는 보조인자 등의 결합) 를 진행할 수 있으며, 소분자 화합물 억제제의 선별 및 그 약리 메커니즘 연구에 사용된다.
단백질 구조 연구: 단백질 결정은 단백질 구조를 연구하는 매우 중요한 수단으로 DSF를 이용하여 단백질의 결정 조건을 높은 통량으로 선별할 수 있다.
DSF 기술 원리:
차시 스캐닝 형광법 (DSF) 은 온도가 상승하거나 변성제가 존재할 때 형광 발사 스펙트럼의 상응하는 변화를 감지하여 단백질의 변성 변환 온도 (열 변환 온도 Tm 값 또는 화학 변성 Cm 값) 를 결정하는 비용 효율적이고 사용하기 쉬운 생체 물리 기술이다.
연구에 따르면 단백질분자에서 방향환아미노산이 부동한 극성의 미환경에 처해있을 때 (예를 들면 소수나 친수환경에서) 자극된 내원형광의 최대발사스펙트럼이 변위된다.단백질 중 내원 형광은 주로 트립토판 (Trp), 페닐알라닌 (Phe) 과 타이르 (Tyr) 와 같은 방향환 아미노산을 함유하고 있으며, 그 중 트립토판은 내원 형광이 강하다.
트립토판의 경우 단백질이 소수인 내핵 미세 환경에서는 내원 형광의 최대 발사 파장이 330nm 정도이고, 친수의 극성 미세 환경에서는 트립토판의 내원 형광의 최대 발사 파장이 350nm 정도로 나타난다.단백질의 열변성이나 화학변성은 일반적으로 트립토판 잔기 주위의 미세환경의 극성에 변화를 초래하여 일반적으로 단백질의 소수내핵에 파묻힌 트립토판이 점차 친수의 환경에 노출되여 내원형광의 최대발사파장에 홍이동 (Red Shift), 즉 더욱 큰 파장구역으로 이동하게 된다.
색암모니아 내원 형광의 변화를 모니터링하는 이 방법은 형광 프로브나 라벨이 필요 없어 전통적인 외원 형광 DSF에서 배경 형광 및 비특이 흡착 등 가짜 양성 결과를 피할 수 있다.
단백질이 열변성이나 화학변성제 (예: 염산구니딘, 요소 등) 의 작용으로 인해 접혀졌을 때, 내원형광을 측정하면 온도나 변성제의 변화에 따라 단백질의 전개 과정을 연구할 수 있다.이러한 변경된 데이터는 용해 곡선을 생성하고 표관열 변환 온도 Tm 값을 얻는 데 사용될 수 있습니다.Tonset、판더화변(H), 깁스자유에너지(G), 화학변성 Cm 값 등은 단백질 안정성 평가와 예측에 사용된다.
기존 DSF는 데이터 분석을 위해 350/330 비율법을 자주 사용했지만 SUPR-DSF는 다양한 분석 방법을 제공했다. 비율법 외에도 SUPR-DSF는 BCM (Barycentric mean, 질심 평균법) 을 제공하여 350/330 비율법보다 더 좋은 노이즈 비율을 얻을 수 있으며 저농도 단백질 샘플의 분석에도 더 유리하다.
고통량 단백질 안정성 분석 DSF 시스템의 주요 특징:
특수 소모품과 모세관이 필요 없는 표준 384 마이크로 홀
온도 상승 프로세스 (60-80분) 내에 완료되는 높은 패스스루 필터링
단일 384 마이크로 공판의 테스트는 내원 형광을 이용하여 염료나 라벨이 필요 없으며, 상용 생물 체계인 UV LED 자극과 호환되어 전체 스펙트럼 검사에 배합된다
10-30 μl 샘플만 필요, 샘플 농도 0.05~250 mg/mL
주요 매개변수 획득: Tonset, Tm, Η, G, Cm 및 친화력 등
엄격한 데이터 품질 및 반복성 제공
SUPR-DSF 시스템 적용:
SUPR-DSF 시스템은 생명 과학 기초 연구 및 약물 개발과 같은 다양한 분야에 널리 사용됩니다.
돌연변이 필터링 속도 향상
레시피 및 사전 레시피 필터링 및 최적화
단백질 결정 조건 선별
배치 간 정합성 평가
생물 유사성 평가
가속 응력과 강제 분해 연구
결합 유도적 구조 변화 분석
번역 후 손질 평가
항온 및 화학 안정성 분석
고통량 단백질 안정성 분석 DSF 시스템의 기술 사양:
일반적인 애플리케이션 사례 -돌연변이 필터링 속도 향상
SUPR-DSF를 사용하여 야생형 단백질 (WT) 1 개와 단일 돌연변이 15 개를 포함하여 16 개의 샘플을 비교 및 필터링합니다.1.5시간 동안 DSF 계측기는 48개의 샘플(세트당 3회 반복)의 고품질 용해 곡선(동일 시간 동안 최대 384구멍의 데이터를 생성할 수 있음)을 생성했다.모델을 사용하여 데이터를 맞추면 용해 온도 Tm 값을 얻고 안정성을 정렬하고 필터링할 수 있습니다.
그림 1과 같이 WT (파란색) 에 비해 이 중 3개 돌연변이 (9, 13, 14) 의 용해 곡선이 왼쪽으로 이동하는 것은 단백질 안정성이 떨어진다는 것을 설명한다.나머지 12개 돌연변이의 안정성이 모두 향상되었다.그 중 돌연변이 1, 8 및 12의 안정성이 가장 크게 향상되었습니다.
그림 2는 몇 가지 대표적인 샘플의 용해 곡선을 보여줍니다. 일부 단백질은 단일 열 변환 과정 (WT 단백질과 돌연변이 7 및 8) 이 발생했고 다른 일부 단백질 (돌연변이 1 및 14) 은 두 개의 열 변환 과정, 즉 용해 곡선에 두 개의 변곡점이 있음을 분명히 보여줍니다.SUPR-DSF가 제공하는 데이터를 통해 연구자들이 유망한 후보물을 선별하여 깊이 연구하는 데 도움을 줄 수 있다.
단일 저항이 정확하게 해결된 Fab 영역
SUPR-DSF를 사용하여 NISTmAb(NIST 단항 표준품)의 차시 스캔 형광 데이터를 획득하고 결과를 차시 스캔량 열법(DSC)에서 얻은 데이터와 비교합니다.SUPR-DSF는 NISTmAb의 CH2(69°C), CH3(83°C), Fab 영역(94°C)의 세 가지 구조 도메인을 모두 분석할 수 있습니다. SUPR-DSF의 최고 스캔 온도는 105°C이며, 비정상적으로 안정적인 Fab 영역 용해 온도를 정확하게 측정할 수 있습니다. 다른 DSF 플랫폼의 스캔 최고 온도는 95°C에 불과하여 Fab 영역의 중요한 5°C(다이어그램)을 분실하기 쉽습니다.
SUPR-DSF를 통합한 데이터와 DSC 결과를 비교합니다.그림 5 (b) 에서 볼 수 있듯이 세 개의 봉우리가 서로 일치하여 SUPR-DSF를 사용하면 고품질의 단백질 안정성 정보를 쉽게 얻을 수 있는 두 가지 기술의 좋은 일치성을 증명했다.
일반적인 응용 사례 - 액티브 디톡스 단항 보조 재료 및 레시피 필터링 가속화
항체와 같은 바이오 치료제의 처방은 약효, 생산 타당성 및 안전성을 보장하는 기초이며 저장 및 운송의 조건도 결정됩니다.제약 기업은 최적의 제조 방법을 결정하기 위해 대량의 조건 조합을 신속하고 안정적으로 선별할 수 있는 높은 통량의 방법을 시급히 필요로 한다.
SUPR-DSF를 사용하여 연구자들은 96가지 다른 조건에서 치료성 항체인 글루타르 단항의 안정성을 선별하고 분석하여 1.5시간 이내에 테스트를 완료했다.테스트 결과는 차시 주사량 열법(DSC) 결과와 매우 일치합니다.랩 자동화 장치를 통합하면 매일 수천 개의 샘플을 필터링할 수 있습니다.
DSF 용해곡선은 두 개의 독립된 변환 영역을 나타내며, 최소 2승법으로 데이터를 입안하여 Tonset 값, Tm 값, 밴더화 변(△H)을 확정할 수 있다. 그림 3(a, b)은 안정성을 파괴/강화하는 부재료의 용해곡선과 입합도를 각각 보여준다.그림 4 (a) 에는 항체의 안정성을 향상시킬 수있는 모든 부자재 (대조 샘플에 비해) 가 나열되어 있습니다.
SUPR-DSF는 그림 4 (b) 에서 볼 수 있듯이 SUPRDSF 데이터는 뛰어난 신뢰성과 일관성을 제공하면서 놀라운 높은 트래픽을 제공하는 동시에 이미 출시 된 크랙토판 단항에 사용되는 보조 재료 인 암모니아와 해조당의 안정성 작용을 정확하게 감별합니다.
고통량 차시 스캐닝 형광법 을 이용하여 결합 파라미터 를 얻다
결합분석연구는 약물연구개발의 관건적인 분야로서 상호작용의 특징과 KD값 (해리균형상수, 표징분자간의 결합친화력) 이 후보물의 선택에 극히 중요하며 연구자는 여러가지 원리를 상호보완하는 방법으로 문고에 있는 수천종에서 수만종의 소분자화합물을 선별하고 확정해야 한다.
SUPR-DSF를 통한 분자 상호작용 분석은 표면 효과, 물질 이동(mass transport)이나 완충액 굴절률 문제 등의 요인 없이 분석물 결합 농도 범위 내에서 높은 통량, 표시 없는 측정이 가능하다.
단백질-배합체 복합체의 안정성 변화를 측정해 결합의 특이성을 확인하는 데 활용할 수 있다.열변성 시 형광 발사 스펙트럼의 변화와 배체 농도의 함수 관계를 통해 KD 값을 계산할 수 있습니다.매우 약한 결합 분자의 경우에도 결합이 유도하는 안정성 변화는 SUPR-DSF에 의해 감지 될 수 있습니다.
표준 384 마이크로 보드를 사용하면 하루 동안 수천 개의 샘플의 안정성을 선별하여 결합 상태를 확인할 수 있습니다.
SUPR-DSF를 사용하여 배합체 (TFMSA) 와 사람 탄산수소 효소 I의 결합 작용을 연구하는데, 탄산수소 효소가 TFMSA 농도에 따라 변화하는 용해 곡선은 그림 6과 같다.
그림 7은 사람 탄산수소 효소 I의 Tm 값과 TFMSA 농도의 관계를 보여줍니다. 의합으로 얻은 KD 값은 각각 2.1μM과 174.2μM으로 두 개입니다.
문헌의 수치가 일치하여 SUPR-DSF가 배합체 결합 연구의 사전 선별 또는 확인 도구로 사용될 수 있으며 민감도를 가지고 있음을 증명합니다.
직관적이고 단순한 소프트웨어
SUPR-DSF 소프트웨어는 직관적이고 간결하며 지능적이고 효율적인 실험 설계 및 데이터 분석 기능을 제공하여 초보자가 빠르게 접근할 수 있을 뿐만 아니라 경험이 풍부한 베테랑 사용자에게 다양한 진급 옵션을 제공할 수 있다.
ProteinStable 정보
