생물 시약

하나,지원체 검사 시약함의 특징:

(1) 1μl 배양세포 상청액과 수욕솥 1대만 있으면 게놈 DNA를 추출할 필요가 없고 형광현미경, PCR기, 전기수영기, 겔영상기, 생물발광검사기 등 복잡한 실험설비가 필요하지 않다.

(2) 1h만 결과가 나오면 간단하고 빠르고 민감한 세포지원체 검사방법;

(3) 한걸음의 조작으로 전반 실험을 완성하기만 하면 실험결과는 반응액의 색갈변화에 따라 육안으로 직관적이고 쉽게 분별할수 있으며 전기수영이 필요하지 않아 여러걸음의 조작으로 뚜껑을 열면 초래되는 가양성위험을 피면할수 있다.

(4) 민감도는 PCR법보다 훨씬 높아 세포배양에서 흔히 볼수 있는 여러가지 지원체 (돼지코지원체, jing아미노산지원체, 구강지원체, 래씨무담스테롤원체, 발효지원체, 타액지원체, 인간형지원체, 배지원체로서 지원체오염의 98%) 를 검사할수 있다.

2.지원체 검사 시약함구성(25T):

3. 실험단계:

(1) 테스트 대기 세포 배양액 상청 준비

세포를 2-3일 배양하고 녹는 정도가 80% 이상일 때 세포배양액 200μL 이상의 부피를 취하여 200g에 따라 5분간 원심분리한 후 청액을 취하여 후속검사를 진행한다(관 밑부분 50μl 배양액 및 세포침전을 취하지 않으면 된다).

(2) 반응체계 배합(먼저 용액A, 용액B, 양성대조, 파라핀오일을 해동하여 녹인 후 즉시 얼음에 배치)

용액 A를 -20 ℃ 에서 꺼내 해동하여 녹인 후 위아래를 가볍게 뒤집어 섞는다.측정 대기 세포 샘플 수에 따라 미량 원심관에서 다음과 같은 반응 체계를 조제 (반응 체계 조제 과정은 얼음 위에서 매우 중요하다);

비고: 매 실험마다 1개의 음성대조, 1개의 양성대조 및 이액기에 이액오차가 존재하기에 N개의 견본을 검사할 때 일반적으로 N + 3개의 상기 반응체계를 조제할것을 추천한다.

진동기로 가볍게 섞은 후 PCR 튜브에 분장 (200 μl 부피 PCR 튜브 권장), 각 튜브에 24 μl 상기 혼합 후 반응액을 분장한다;

(3) 샘플링 (전체 샘플링 과정은 얼음 위에서 진행하는 것을 유지하는 것이 매우 중요하며, 특히 반응액 위에 덮인 파라핀 오일은 얼음 위에서 미리 차가워야 한다)

측정 대기 샘플: 반응관에 측정 대기 원심 1μl를 첨가한 후 배양액이 상청된 후 이 가액총으로 위아래로 이동하여 가볍게 5회 분다;

음성 대조: 어떠한 샘플도 첨가하지 않거나 무균수 1μl를 첨가하지 않는다.

양성대조: 양성대조시료 1μl를 첨가한 다음 이 가액총으로 위아래로 이동하여 가볍게 5회 분다.

그런 다음 각 반응관 용액 위에 파라핀 오일 25μl(수욕솥에서 반응)을 가볍게 넣어 액체 증발로 인한 부정확한 결과를 방지한다.파라핀 오일을 넣을 때 매번 총머리를 교체하여 샘플 사이의 교차 오염을 방지하는 것을 주의하십시오.만약 반응이 PCR 기기에서 반응한다면 파라핀 오일을 넣을 필요가 없다.

(4) 반응

수욕솥이나 PCR기 온도를 61 ℃ 로 설정하고 반응관에 넣어 60min 부화한다.

참고:

1. 수욕솥의 실제 온도는 설치 온도와 차이가 있을 수 있으므로 먼저 온도계로 교정하는 것을 권장한다.실제로 59~63 ℃ 반응은 모두 할 수 있지만 검사 민감도에 영향을 줄 수 있습니다.

2, 반응 산물은 뚜껑을 열 수 없다. 그렇지 않으면 발생하는 에어로졸은 후속 검사 가짜 양성의 출현을 초래할 수 있다.반응관을 비닐봉지나 장갑에 싸서 전용 쓰레기통에 버리고 제때에 정리하는 것을 권장한다;

3. 오븐이나 금속욕을 사용하여 가열반응을 하는 것을 권장하지 않는다;

(5) 결과판단

61 ℃ 반응 60min 후 즉시 반응관을 꺼내 실온에 놓는다.광선이 좋은 환경에서 반응 결과를 관찰합니다 (흰 종이를 배경으로 권장).반응액이 여전히 청자색이면 음성으로 판정한다.반응액이 하늘색이면 양성으로 판정된다.

4. 관련 문헌

1, ShiyuHe, YanzhiHuang, YanlingZhao.AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease.FrontiersinMicrobiology.2020;12(11):734-743.

2, AudreyJean, FlorenceTardy, OmranAllatif.세포 배양의 마이코플라스마 오염을 평가하는 것은 16SrRNA 유전자의 1.5kb 조각을 표시하는 유니버설 살프라이머 161616SrRNA 유전자에 의한 세포 배양의 오염을 평가합니다.PLOSONE.2017;12(2):e0172358.

3, ZohreSoheily, MohammadSoleimani, KeivanMajidzadeh-Ardebili.미코플라즈마 오염 감지 세포 문화 루프 매개 동열 증폭 방법.CellJ.2019;21(1):43-48.

4, XinXu, XueyuWang, WenHu.개선된 중합酶 교차 연결 나선형 반응 분석 Rapid Diagnosticof CanineParvovirus2 감염.FrontiersinVeterinaryScience.2020;7(57):1629-1636.