2025년 4월 4일 미국 캘리포니아 스크립스 연구소의Kendall W. Nettles 교수화John R. Yates III 교수는 공동 교신저자로서 nature chemical biology 잡지에'Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer'라는 제목의 글을 게재했다.이 문서는Native top-down proteomics(nTDP) 정책, 유방암 세포(과발현표피성장인자수용체(EGFR)의 내분비 저항 모델 포함) 중 ≤70kDa를 식별하는 데 사용되는 단백질 그룹 복합체로 총 검출17 단백질 복합체의 104 complexoforms(단백질 복합체의 특정 조립 형태).이 연구에서 EGFR은 핵운반인자2(NUTF2) 조립체의 해리를 유도하는데, NUTF2의 K4와 K55는 번역 후 수식 위치가 에스트로겐 수용체(ER) 신호 통로 억제에 차별화된 영향을 미치는 것으로 나타났다.이 연구는 유방암 단백질 그룹의 분자 특성 및 종양 성장과 치료 저항에 대한 complexoforms의 역할을 밝혀 질병 메커니즘을 이해하고 약물을 개발하는 데 새로운 시각을 제공했다.

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일

연구 배경

WHO의 국제암연구기구가 최근 발표한 수치에 따르면 2020년 전 세계 유방암의 새로 발생한 병례는 226만건에 달해 페암의 220만건을 초과했다.유방암은 이미 폐암을 대체하여 세계 제일의 암이 되었다.단백질은 비공가 상호작용을 통해 기능복합체를 조립하여 형성하는데 구동세포내에는 유방암 등 악성종양과 관련된 거의 모든 관건적인 기능이 포함되는데 단백질은 차이커팅, 서렬변이, 번역후수식(PTMs) 또는 돌연변이로 인한 여러가지 proteoform이 이런 기능복합체의 형성, 안정성 및 활성에 영향을 준다.전통적인 하향식 단백질 그룹학 방법은 단일 단백질이 생성하는 proteoform, 표징과 단백질 복합체가 결합된 배합체와 보조인자를 밝히고 조합 PTMs 모델을 그리는 데 한계가 있다.네이티브 스펙트럼(Native MS)과 톱다운 프로테오믹스(Top-down Proteomics)가 결합해 형성된 네이티브 톱다운 프로테오믹스(nTDP)는 구조적 해석 능력은 있지만, 복잡한 생체 샘플에서 단백질 복합체의 풍도가 낮아 단백질 복합체 분리가 어렵고 대규모 nTDP 데이터 세트를 처리하는 생체정보학 도구가 부족한 등의 문제로 인해 nTDP는 현재 주로 순화된 생체 중 단백질 복합체에서 복잡한 생체 분석에 사용되고 있다.유방암 연구에서 성장인자 신호 전도는 내분비 치료 저항의 주요 메커니즘 중 하나이며, 표피 성장인자 수용체 (EGFR) 증폭 및 하류 신호 성분 돌연변이는 임상 타모스핀 저항과 관련이 있지만 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않다.따라서 유방암 세포에서 단백질 조립체의 특징을 연구하여 질병의 분자 메커니즘을 깊이 이해하고 효과적인 약물을 설계하는 효과적인 방법이 필요하며, 이는 nTDP 전략을 개발하고 적용하는 데 배경과 동력을 제공한다.

이

연구 방법

1

연구 대상:

에스트로겐 수용체 알파(ER α) 양성의 MCF-7 유방암 세포(후속칭 MCF-7 세포)와 표피성장인자 수용체(EGFR)를 과발현하는 MCF-7 세포(ER 표적치료의 내약 모델로 후속칭 MCF-7-EGFR 세포).

2

nTDP 워크플로우

연구자가 개발한 nTDP 워크플로우는 그림 1과 같이 먼저 오프라인 native 사이즈 저항 크로마토그래프(nSEC)를 이용해 세포에서 가용성 단백질 복합체를 추출해 분리한다.그런 다음 nano-ESI – FAIMS – MSn(액상: Easy-nLC 1200, 기상분리장치: FAIMS, 질량분석: Orbitrap Fusion Lumos)단백질 복합체에 대해 native top-down의 표징 분석을 진행한다.마지막 이용ProSight 네이티브소프트웨어는 복잡한 스펙트럼 데이터를 수동으로 보정 처리합니다.

그림 1: nTDP 워크플로우 (큰 그림을 보려면 클릭)

삼

연구 결과

1

nTDP 워크플로우 검증

연구자들은 먼저 세 가지 단백질 복합체를 이용한다.carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa)nano-ESI – FAIMS – MSn 시스템의 재현성과 안정성을 확인합니다.그 결과 이 시스템은 단백질 복합체를 안정적으로 분리, 파열시켜 단백질 표징을 효과적으로 밝힐 수 있는 질량 스펙트럼 데이터를 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다 (그림 2-4).아울러 FAIMS가 70kDa까지 높은 단백질 복합체를 기상 수준에서 분리할 수 있다는 점도 검증했다.(그림 5)

그림 2: CA II의 nTDP 스펙트럼과 ProSight Lite에 의해 생성된 파편도(큰 그림을 보려면 클릭)

그림 3: SA의 nTDP 스펙트럼과 ProSight Lite에 의해 생성된 파편도(큰 그림을 보려면 클릭)

그림 4: AV의 nTDP 스펙트럼과 ProSight Lite에 의해 생성된 파편도(큰 그림을 보려면 클릭)

그림 5: 표준 단백질 복합체의 기본 피크 마이그레이션 맵 및 CV 값

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2

nTDP 분석 MCF-7 및

MCF-7 – EGFR 세포 추출물

이후 연구자들은 nSEC 시스템으로 유방암 세포(MCF-7과 MCF-7-EGFR)의 세포 추출물을 분리했는데, nSEC 스펙트럼 결과 MCF-7과 MCF-7-EGFR(16회 반복 실험)에서 추출한 단백질 복합체가 모두 안정적이고 효과적으로 분리되는 것으로 나타났다.분리된 단백질 복합체를 nano-ESI – FAIMS – MSn 시스템으로 검사하여 총 측정17 단백질 복합체의 104 complexoforms단백질-금속 복합체, 단백질-단백질-금속 복합체 및 단백질-단백질 복합체를 포함한다.

그림 6: MCF-7의 단백질 표식과 단백질 집합체의 nSEC 스펙트럼, MCF-7 세포의 단백질 집합체 접착도, MCF-7-EGFR의 단백질 표식과 단백질 집합체의 nSEC 스펙트럼, MCF-7-EGFR 세포의 단백질 집합체 접착도.(큰 그림을 보려면 클릭)

3

유방암 관련 단백질 복합체 표징 분석

• TPI 복잡한 형태:TPI는 유방암과 관련된 당효소 효소로, TPI가 약물 내성, 종양 진행 및 전이와 관련이 있을 수 있다는 연구 결과가 있다.연구자들은 MCF-7과 MCF-7-EGFR 세포에서 모두 TPI 이중합체 구조를 관찰했으며 분자 질량은 약 53kDa(nSEC-fraction4)였다.이중합체 TPI 복합체는 짧고 인산화된 단일 단백질 변체를 조합해 형성되며, 단일 단백질 변체에서 2개의 탈아미드(N15와 N71)가 발생한다.연구자들은 또한 돌연변이 (E104D) TPI 단일체로 형성된 TPI 복합체를 발견했으며, E104D 단일체 아기의 TPI는 인산화, 탈아미드화 또는 아세틸화될 수 있다.

그림 7: MCF-7 세포 추출물 중 TPI complexoforms 복합체의 nTDP 스펙트럼 (큰 그림을 보려면 클릭)

• MIF 복잡한 형태:MIF는 다양한 암, 자가면역질환, 염증에서 생물학적 관련성을 가진 다기능 세포인자로, 연구자들은 MIF가 MCF-7과 MCF-7-EGFR 세포에서 모두 높게 발현된다는 것을 발견했다. native MS1 스펙트럼은 MIF complexoforms의 상세한 정보를 제공하여 모두 다섯 가지 MIF(동원과 이원) 삼중합체 구조를 형성했다.S 를 통해n의 스펙트럼 분석은 짧고 수식되지 않은, 아질화 및 아세틸화 된 MIF 단일 단백질 변형 (아질화 및 아세틸화는 각각 C80과 K77에서 발생) 을 발견했습니다.

그림 8: MCF-7 세포 추출물 중 MIF complexoforms 복합체의 nTDP 스펙트럼 (큰 그림을 보려면 클릭)

• SOD1 복합형태:금속 효소 SOD1은 암 유전자에 의해 구동되는 유방 종양 형성 및 초산화물을 O로 변환하는 데 중요한 항산화제입니다.2및 H2O는2매우 중요하다.연구자들은 MCF-7과 MCF-7-EGFR 세포에서 분자 질량이 약 32kDa인 SOD1 이중합체 구조를 관찰했으며, MS1 스펙트럼(11 + 전하 상태)과 MS2 스펙트럼(6 + 전하 상태)에서 SOD1 단백질 변형 아기 중 Cu가 관찰되었다2+및 Zn2+금속 이온의 비공가 결합, SOD1 단백질 변형은 N단 아세틸화, 1 쌍 2 황 키 (C57-C111) 및 N-단 메틸 황 아미노산의 절제도 가지고 있습니다.

그림 9: MCF-7 세포 추출물 중 SOD1 complexoforms 복합체의 nTDP 스펙트럼 (큰 그림을 보려면 클릭)

• NUTF2 복합형식:NUTF2는 작은 GTP 효소인 Ran의 핵 내 이송을 매개하는 이중합체 단백질이다.연구자들은 MCF-7과 MCF-7-EGFR 세포로부터 26종의 다른 complexoforms에 분포된 8종의 다른 PTM 조합의 NUTF2 단백질 변형을 모두 감정했다.MS1 스펙트럼에서 MCF-7 세포에 비해 MCF-7-EGFR의 내원성 NUTF2 2중합체 복합체 함량이 현저히 감소하고 아세틸화 3개를 가진 NUTF2 이중합체는 MCF-7-EGFR 세포 특유의 것으로 밝혀졌다.

그림 10: MCF-7 및 MCF-7 – EGFR 세포 추출물 중 NUTF2의 nTDP 스펙트럼 (큰 그림을 보려면 클릭)

그림 11: MCF-7 및 MCF-7 – EGFR 세포 추출물에서 NUTF2 complexoforms 및 proteoforms의 강도 정보 (큰 그림을 보려면 클릭)

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4

NUTF2는 EGFR 및 ER 레인 간의 상호 작용을 유도합니다.

초기 nTDP 데이터 결과 MCF-7-EGFR 세포에서 NUTF2 2중합체의 수가 MCF-7 세포에서 현저하게 낮은 것으로 밝혀졌으며, 연구자들은 NUTF2를 이용해 두 가지 다른 친화 라벨과 함께 침전시켜 검증했다EGFR은 핵운반 인자 2 (NUTF2) 이중합체의 해리를 유도할 수 있다는 결론. NUTF2의 번역 후 수식(PTM) 비트는 척추동물에서 보수성을 가지고 있으며, NUTF2 단백질 복합체의 결정 구조는 K4가 핵구멍 단백질 결합 비트에 가깝다는 것을 보여준다.K55와 K63은 Ran 결합 비트에 가깝고 이 중 K55는 Ran과 NUTF2 사이의 물 매개 접촉에 관여하기 때문에 연구자들은 K4와 K55 비트에 돌연변이를 일으켰다.그 결과,MCF-7 세포에서 NUTF2의 발현은 유방암 세포의 성장을 억제하며, K4Q 돌연변이는 이 억제를 역전시킬 수 있고, K55R 돌연변이는 억제를 강화한다, 이것은 PTM 비트 (K4, K55) 가 핵 구멍 결합 또는 Ran 상호 작용에 영향을 미쳐 세포 성장을 조절 할 수 있음을 나타냅니다.NUTF2는 에스트로겐이 유도하는 증식 유전자인 GREB1을 하향 조정했고, K4Q 돌연변이는 4OHT 없이 이 표형을 회복할 수 있다.이는 서로 다른 PTM 비트의 NUTF2 proteoforms가 서로 다른 생물학적 결과를 초래할 수 있음을 나타냅니다.

그림 12: NUTF2는 ER의 신호 전도를 조절하고 성장을 억제한다

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NUTF2가 ER 신호 전도와 4OHT에 대한 응답을 어떻게 조절하는지 더 연구하기 위해 CUT&RUN 기술 분석을 통해 MCF-7 세포에서 ER와 NUTF2의 결합 비트는 기본적으로 겹치지 않지만 NUTF2 발현과 4OHT 처리는 ER의 결합 패턴을 바꾼다는 것을 발견했다.NUTF2 표현은 1353 비트에서 ER의 결합에 차이가 발생하며 4OHT 처리 후 MCF-7과 MCF-7NUTF2는세포의 ER 결합 위치는 중첩도 있고 차이도 있다.그러나 4OHT의 민감한 NUTF2 비트에서 총 132개의 ER 베이스 서열 반비트 (즉'1-AGGTCA') 만 발견되었는데, 이는 NUTF2가 간접 메커니즘을 통해 ER 염색질 점유율과 활성을 조절한다는 것을 보여준다.연구자들은 NUTF2 성장 억제의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 MCF-7과 MCF-7NUTF2 세포의 RNA-seq를 완료했다. 유전자 집합 분석에 따르면 600여 개의 차이 발현 유전자 중 상향 RNA 분해 대사 관련 유전자, NURD 복합체 성분 (예: HDAC1) 과 멸망 유전자 ERRFI1, 하향 미토콘드리아 산화 인 산화 관련 유전자 (예: BCRAS) 와 발암 유전자) 를 포함한다.패스스루 리치 분석에 따르면 이러한 유전자는 다양한 암 및 EGFR 관련 패스와 관련되며 EGFR 신호 효과 인자로서 NUTF2의 역할을 지원합니다.ER α-APEX2 인접 단백질 그룹학 연구에 따르면 NUTF2 발현은 JunB 마커 증가, 종양 억제 인자 HSPBP1 및 CSDE1 마커 감소 등 ER의 상호작용 그룹을 변화시킨다.NUTF2: WT와 NUTF2: K4Q 세포를 비교한 결과, CNOT9 태그 증가, DNMT3A 태그 감소와 같은 ER 상호작용 그룹에 차이가 있음을 발견하여 NUTF2가 ER 관련 단백질 상호작용을 조절하여 통로에 영향을 미친다는 것을 더욱 확인하였다.

그림 13: NUTF2-ER의 상호 작용

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사

결론과 의미

1

nTDP 방법학의 성공적인 구축 및 응용

nTDP workflow를 최적화한 이 연구는 오프라인 네이티브 사이즈 저항 크로마토그래프(nSEC), 나노 스프레이 이온화(nano-ESI), 필드 비대칭 이온 이동 크로마토그래프(FAIMS)와 다단계 직렬 질량 크로마토그래프(MSn)를 결합해 유방암세포(MCF-7 및 MCF-7-EGFR)에서 17종의 단백질 복합체를 검출하는 104종의 complexoforms 단백질 내성 단백질, 저단백질 복합체 내성 단백질-복합체 시료 극복에 성공했으며, 다크롬-복합체 내성 단백질-복합체 내성 단백질-복합체 내성 단백질-복합체 등 복합체 시료는 ≤70의 복합체 내 복합체 내 복합체 시료, 복합체 내 복합체-단백질-단백질-복합체-복합체 내성 단백질-복합체 도 단백질 복합체의 한계.

2

핵심 단백질 복합체의 발견과 기능 분석

암과 관련된 핵심 단백질 복합체, 예를 들면 인산 프로테아제 (TPI), 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), 초산화물 기화 효소 (SOD1) 의 complexoforms를 식별하고, 그 번역 후 수식 (PTMs) 비트 (예를 들면 TPI의 탈아미드, 인산화, MIF의 아질화, 아세틸화, SOD의 기능과 그 결합점 등의 결합이 금속 구조에 미치는 영향을 명확히 했다.핵심 발견: EGFR 과발현은 핵운반인자2 (NUTF2) 이중합체의 해리를 유도한다.NUTF2 이중합체는 핵구멍 셔틀 단백질로 RAN의 핵 입력에 참여하며, 그 과발현은 유방암 세포의 성장을 억제할 수 있으며, 서로 다른 PTM 비트 (K4와 K55) 의 돌연변이는 이 억제 효과를 역전시키거나 심화시켜 NUTF2의 PTMs가 에스트로겐 수용체 (ER) 신호 통로를 조절하여 유방암의 성장을 촉진한다는 것을 보여준다.

3

NUTF2와 유방암 내분비 저항의 연관 메커니즘

NUTF2는 에스트로겐이 유도하는 증식 유전자인 GREB1을 하향 조정하고 사멸 유전자인 ERRFI1을 상향 조정하는 등 ER의 DNA 결합과 단백질 상호작용 네트워크를 간접적으로 조절해 ER 신호 통로에 영향을 미쳐 유방암 세포 성장을 억제한다.EGFR 과발현 (내분비 치료 저항 모델) 은 NUTF2 2중합체 수준을 감소시키고 PTMs 모드를 변경하여 ER 신호에 대한 NUTF2의 조정 작용에 이상을 초래할 수 있으며, EGFR이 유도하는 타목시핀 저항의 중요한 메커니즘 중 하나일 수 있다.

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nTDP의 영역적 의미

이 방법은 복잡한 생체 샘플에서 내원성 단백질 복합체의 대규모 분석에 새로운 패러다임을 제공하여 취약한 비공가 상호작용을 보존할 수 있으며, proteoform의 PTMs, 조립 모델 및 배체 결합을 정확하게 표징하여 암 생물학, 약물 표적 발견 및 구조 생물학 연구에 새로운 경로를 개척할 수 있으며, 특히 유방암 치료 저항의 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 견해를 제공한다.

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