피치 효모 표현 시스템 및 발효 공정

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날짜:2025-01-02읽기 :2

1. 필적효모표현시스템 소개

피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 표현 시스템은 효율적인 진핵 표현 시스템으로서 피치아 효모 표현 시스템은 광범위한 응용 분야와 현저한 장점을 가지고 있다.다른 표현 시스템에 비해 필적효모 표현 시스템의 장점이 뚜렷하다.그것은 현재 강하고 조절 기능이 엄격한 시동자 중 하나인 알코올 산화 효소 유전자 AOX1 시동자를 가지고 있으며, 이는 외부 유전자의 발현 조절을 더욱 정확하고 효율적으로 한다.그 표현수준이 높아 포내표현을 실현할수 있을뿐만아니라 분비형표현도 진행할수 있어 부동한 연구와 생산의 수요를 크게 만족시켰다.발효공예가 성숙되고 확대하기 쉬우며 이미 대규모 공업화 고밀도 생산능력을 갖추어 산업화 발전에 편리한 조건을 제공하였다.배양원가가 낮고 산물이 쉽게 분리되며 사용하는 발효배양기가 저렴하고 단백질이 함유되지 않아 하류제품의 분리순화에 유리하여 생산원가를 낮추었다.외원단백질유전자는 유전이 안정되여 필적효모염색체에 통합된후 염색체가 복제됨에 따라 안정적으로 존재할수 있으며 쉽게 잃어버리지 않는다.또한 진핵표현시스템으로서 피치효모는 진핵생물의 아세포구조를 갖고있어 표현된 단백질에 대해 당기화, 지방아세틸화, 단백질인산화 등 번역후 수식가공을 진행할수 있어 표현된 단백질이 구조와 기능면에서 천연단백질에 더욱 접근하고 더욱 높은 생물활성을 가질수 있다.

2. 필적효모 표현 시스템 구성

1. 숙주균

현재 외원 단백질 발현에 사용되는 피치 효모 숙주균은 Mut + 메탄올 이용형 GS115, X-33, SMD1165, SMD1163 및 SMD1168 등 대부분 숙주균이다.MutS 메탄올은 느린 KM71을 사용합니다.Mut-메탄올 비이용형 MC100-3.상세히 아래 표 를 보면 필적효모 의 다른 표현 숙주균 및 표현 특징 을 상세히 열거하였다

표1 흔히 볼 수 있는 필적효모는 숙주균과 특징을 나타낸다

균주	특징
GS115는	높은 표현 수준, 높은 세포 밀도, 높은 가용성 단백질 생산량을 가지고 있으며, 현재 널리 응용되고 있는 숙주균
KM71은	메탄올은 완만형을 이용하여 용해되기 어려운 단백질을 표현하는데 적합하다
X33는	표현량과 활성을 높여 재조합 단백질 표현에 적합
SMD1168H는	더 나은 발현 효율과 더 높은 세포 밀도, 대분자 단백질 발현에 적용
SMD116(his4 pep4)	단백질효소결핍형균주에 속하며 단백질분해를 감소시켜 단백질분해로 인한 표현산물의 분포가 고르지 못한 문제를 해결할수 있다. 그러나 이 균주는 생장이 상대적으로 완만하여 표현된 외원단백질의 생산량이 비교적 낮을수 있다.
Y-11430은	효율적인 표현 능력 및 조절 가능한 표현

2. 캐리어

비적효모표현담체는 통합형담체를 위주로 하며 흔히 볼수 있는 담체는 포내표현담체와 분비표현담체로 나눌수 있다.

표2 흔히 볼 수 있는 필적효모 표현 숙성체 및 특징

포내표현 캐리어	특징
pPIC3.5K의	AOX1 시동자의 포내표현 담체를 기반으로 높은 수준의 포내표현을 할 수 있다
pPIC3K는	AOX1 시동자의 포내표현담체를 기반으로 필적효모에서 목적단백질을 표현할수 있으며 kanamycin 항성표시가 있다.
pGAPZ는	GAPDH 시동자를 기반으로 한 포내표현 담체로서 중등~높은 수준의 목적단백질을 표현하는데 적용되며 분비 또는 포내표현이 가능하다
pGAPZα	pGAPZ와 유사하지만 알파인자 신호 서열을 가지고 있어 단백질 표현의 안정성과 생산량을 높일 수 있다
포외표현 캐리어	특징
pPICZαA/B/C는	AOX1 시동자의 포외표현 담체를 기반으로 필적효모에서 목적단백질을 표현할 수 있으며 알파인자 신호 서열을 가지고 있어 효율적인 분비 표현이 가능하다
pPIC9K는	AOX1 부팅 하위 기반의 포외 발현 캐리어, 높은 수준의 포외 발현에 사용 가능하며 G418 저항 마커
pPIC3.5K-BGH는	AOX1 시동자를 기반으로 한 포외표현담체로서 베타반유당신효소 신호서렬이 있어 융합단백질의 표현과 분비를 검사하는데 사용할수 있다
pYAM75P는	여러 개의 제한 효소 접점이 함유되어 있어 재조합 조작이 편리하다

3. 필적효모 발효공예

1、피치효모 발효단계

피치효모의 발효는 일반적으로 두 단계로 나뉜다. 1. 세포성장단계: 우선 탄소원이 글리세린 또는 포도당인 배지에서 진행되는 성장단계에서 충분한 세포밀도와 생물량을 축적하고 균체농도가 일정한 단계에 이르렀을 때 글리세린이나 포도당이 소진될 때 용존산소치가 갑자기 100% 좌우로 상승한후 글리세린 또는 포도당 용액을 류입하기 시작하며 통풍량과 교반균량을 유지하여 생물산소의 30% 정도를 진일보 성장시킨다.2. 유도단계: 생물량이 요구에 도달하면 탄소원을 보충하는것을 중지하고 탄소원이 소진되며 과도기가 끝난후 탄소원을 메탄올로 전환하여 목표단백질을 유도표현하는 발효단계를 진행한다.일반적으로 간헐적으로 메탄올 0.3% 를 넣어 두 번 유도한 다음 메탄올 유도 표현 단백질을 흘리기 시작하는데, 이런 방식은 외원 단백질의 표현 수준을 높일 수 있고, 피치 효모가 비교적 짧은 시간 내에 고농도의 목표 단백질을 축적할 수 있다.

유도표현단계는 필적효모의 발효생산과정에서 관건적인 고리로서 이 단계에서 메탄올은 이전의 탄소원을 대체하는 특이성유도제로 사용되였다.비적효모의 알코올산화효소 유전자 (예: AOX1) 가 메탄올의 존재하에 활성화되어 외원 유전자의 효율적인 발현을 구동한다.이 단계의 조건 통제는 외원 단백질의 생산량과 품질에 중요한 영향을 미치므로 메탄올의 첨가량, 첨가 속도 및 발효 환경의 온도, pH 값과 용산소량 등 파라미터를 엄격히 통제하여 외원 유전자가 지속적이고 효율적으로 표현될 수 있도록 보장하는 동시에 메탄올이 세포에 독성 및 기타 불리한 영향을 미치지 않도록 해야 한다.

2. 발효배지의 종류와 레시피

피치 효모 발효 배지의 종류는 다양하며, 서로 다른 배지 레시피는 서로 다른 발효 단계와 목적에 적용된다.

BSM(기초염) 배지는 피치효모 발효에 많이 사용되는 기초배지 중 하나로, 대표적인 처방은 인산 85% 26.7ml/l, 이수황산칼슘 0.93g/l, 황산칼륨 18.2g/l, 칠수황산마그네슘 14.9g/l, 수산화칼륨 4.13g/l, 글리세린 40.0g/l, PTM1 4.35ml/l이다.이 배양기는 피치효모의 성장에 기본적인 영양성분을 제공할 수 있다. 질소원, 인원, 칼륨원, 마그네슘원 등 무기염과 글리세린을 탄소원으로 하고, PTM1은 효모의 성장에 필요한 미량원소와 비타민 등 영양물질을 보충해 효모세포의 정상적인 성장과 대사를 유지하는 데 도움이 된다.

F22 배지 역시 흔히 볼 수 있는 피치 효모 발효 배지로, 그 배합은 서로 다른 연구 및 생산 응용에서 조정될 수 있지만, 일반적으로 적당량의 탄소원 (포도당 또는 글리세린), 질소원 (예: 효모 추출물, 단백질 펩톤 등), 무기염 (예: 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 인산 이수소 칼륨 등) 및 기타 첨가제 (예: 바이오매스, 미량 원소 용액) 를 포함한다.F22 배지는 BSM 배지에 비해 특정 발효 요구를 충족시키기 위해 영양 성분의 구성과 비율에 최적화 될 수 있습니다. 예를 들어 특정 상황에서 외부 단백질의 발현량을 높이거나 단백질의 질을 개선하는 데 더 도움이 될 수 있습니다.

상술한 두가지 흔히 볼수 있는 배양기외에 또 많은 기타 필적효모발효배양기가 있는데 이런 배양기의 조제방법은 흔히 구체적인 실험목적, 균주특성 및 발효공예의 요구에 따라 최적화되고 조정된다.예를 들어, 일부 연구에서는 특정 바탕에 대한 필적효모의 이용 효율을 높이거나 환경 압력에 대한 내성을 강화하기 위해 아미노산, 유기산, 다당 등 특수한 성분을 배지에 첨가한다;또는 배양기 중 탄소원, 질소원, 무기염의 비율을 조정하여 효모세포의 생장과 대사 경로를 최적화함으로써 더욱 높은 발효 효율과 산물 생산량을 실현한다.

3. 발효 공정 매개 변수

비적효모가 발효되는 과정에 공정매개 변수의 정확한 통제는 발효의 성공여부에 극히 중요한 역할을 하는데 이런 매개 변수에는 pH, 온도, 용산소 등이 포함되는데 그들은 서로 련관되고 서로 영향을 주며 비적효모의 생장상황, 대사활성 및 외원단백질의 표현수준을 공동으로 결정한다.

pH 값: 피치 효모 발효에 영향을 주는 핵심 요소 중 하나입니다.피치효모는 성장단계와 대사과정에 따라 pH값에 대한 요구가 다르다.세포의 성장단계에서 일반적으로 적합한 pH범위는 5.0~6.0이다. 이 pH조건에서 효모세포는 량호한 성장상태를 유지할수 있고 효소의 활성도 비교적 잘 발휘될수 있어 세포의 증식과 대사산물의 축적에 유리하다.pH 수치는 피치 효모의 발효 과정에서 균체의 생장 상태에 영향을 줄 뿐만 아니라 외원 단백질의 발현에도 중요한 영향을 미친다.pH 수치가 피치 효모에 미치는 영향은 주로 다음과 같은 측면을 포함한다: (1) 세포 내 효소의 활성에 영향을 주고, 나아가 세포의 신진대사에 영향을 주어 외원 단백질의 발현도 영향을 받게 한다;(2) 세포막의 투과성에 영향을 주고 세포가 영양물질을 흡수하고 대사산물을 배출할 때 일정한 영향을 준다.(3) pH 수치는 배양기 중 성분과 세포의 대사산물의 이해에 영향을 미쳐 세포의 영양물질 흡수에 영향을 미친다.(4) pH수치도 세포의 대사과정에 영향을 미쳐 세포대사산물의 함량을 변화시킬수 있다. 또 고밀도발효과정에서 외원단백질이 단백질효소에 의해 분해되는것을 줄이기 위해서는 단백질효소작용에 가장 적합한 pH수치를 피하고 pH수치를 외원단백질 등 전점에서 벗어나는 곳에 설정해야 하며 외원단백질의 수확률도 제고된다.

온도: 피치 효모의 생장과 대사에도 현저한 영향을 미친다.피치 효모의 생장 온도는 일반적으로 28-30 ℃ 사이가 적당하다.이 온도범위내에서 효모세포는 성장속도가 비교적 빠르고 대사활동이 왕성하여 배지의 영양물질을 능률적으로 리용하여 생장하고 번식할수 있다.그러나 온도가 32 ℃ 를 넘으면 세포가 죽을 수 있습니다. 고온은 세포의 막 구조, 단백질, 핵산 등 생물 대분자의 안정성을 파괴하여 세포의 정상적인 생리 기능에 영향을 줄 수 있기 때문입니다.반면 낮은 온도에서는 세포의 성장 속도가 느려지지만 배양 온도를 적당히 낮추면 표적 단백질의 생산량과 질을 개선할 수 있다는 연구결과도 있다.이는 저온이 세포 내 단백질 접힘의 응력을 낮춰 잘못된 접힘의 발생을 줄이는 동시에 단백질 효소의 활성을 감소시켜 외원 단백질의 수해 정도를 낮춰 외원 단백질의 올바른 접힘과 축적에 유리하기 때문이다.

용산소 (DO): 피치 효모의 발효 과정에서 또 다른 중요한 공정 매개 변수입니다.피치효모는 글리세린과 메탄올을 이용해 성장과 대사를 할 때 산소의 참여가 필요하기 때문에 적절한 용산소 수준을 유지하는 것이 발효의 원활한 진행을 확보하는 데 중요하다.전체 발효 과정에서 보통 용산소 농도를 > 20% 수준으로 유지해야 한다.세포가 성장하는 초기에는 균체의 수량이 비교적 적기 때문에 산소에 대한 수요가 상대적으로 낮기 때문에 이때 적당한 통기와 교반을 통해 세포의 용산소 수요를 만족시킬 수 있다.세포의 성장과 대사활동이 증강됨에 따라 산소에 대한 소모가 점차 증가되고있는데 이때 통기량, 교반속도를 한층 더 조절하거나 순산소보충 등 방식으로 용산소수준을 제고하여 세포가 충분한 산소를 획득하여 대사할수 있도록 보장해야 한다.만약 용산소가 부족하면 세포의 성장이 느리고 대사산물의 축적이 줄어들며 심지어 세포의 사망을 초래하여 발효의 효률과 산물의 생산량에 엄중한 영향을 줄수 있다.

배양시간: 비적효모표현시스템에서 가장 높은 단백질표현수준을 획득하는 가장 관건적인 요소의 하나로서 비적효모표현시스템에서 생산시간이 상대적으로 길다 (약 100h).배양 시간은 효모세포의 수와 목표 단백질의 분해 정도와 관련이 있다. 파스퇴르피치 효모세포의 최고 성장밀도는 배양 96h이고 최고 단백질 발현은 48h(11)에서 발생한다는 연구결과가 있다. 이는 배양 시간이 길면 발현된 단백질이 수해되어 소화될 가능성이 높다는 것을 보여준다. 또 다른 연구에 따르면 가장 좋은 단백질 발현 시간은 배양 72~96h[2]

비적효모 발효 공정은 복잡하고 정교한 과정으로 발효 단계, 배양기 레시피와 공정 매개 변수를 정확하게 제어하고 최적화해야 한다. 실험 설계 (DOE) 방법을 통해 체계적으로 발효 조건을 최적화할 수 있다. 예를 들어 pH, 온도, 용산소와 배양기 구성은 비적효모의 장점을 충분히 발휘하고 외원 단백질의 효율적인 표현과 생산을 실현할 수 있다.비적효모의 발효특성과 수요를 깊이있게 료해하고 선진적인 발효기술과 설비를 결합하여 발효공예를 끊임없이 최적화함으로써 비적효모의 발효효률과 산물의 질을 한층 더 높일수 있다.

4. 필적효모와 발효탱크의"묵계배합"

비적효모의 발효과정에서 발효탱크는 핵심설비로서 비적효모의 생장과 대사에 관건적인 환경조건을 제공하여 외원단백질을 능률적으로 표현할수 있도록 확보하였다.

발효 탱크는 정확한 온도 제어 시스템을 통해 피치 효모에 적합한 생장 온도를 제공한다.앞에서 말한바와 같이 필적효모는 28-30 ℃ 의 생장단계 및 유도표현단계에서 온도에 대한 특정한 요구로서 발효탱크의 온도통제시스템은 이런 설정온도범위내에서 정확하게 유지되여 온도가 너무 높거나 너무 낮으면 효모세포의 생장과 단백질표현에 불리한 영향을 주지 않도록 할수 있다.대규모 발효 생산에서 이러한 정확한 온도 제어는 특히 중요하며, 각 필적효모가 안정적이고 적합한 온도 환경에서 성장할 수 있도록 보장함으로써 생산의 안정성과 중복성을 높인다.

pH 값의 조정에 대해 발효 탱크는 첨단 pH 검사 및 조절 장치를 갖추고 있습니다.비적효모가 발효되는 부동한 단계에서 pH값에 대한 수요변화에 따라 발효탱크는 자동적으로 산염기용액을 첨가하여 pH값을 정확하게 필요한 범위내에서 유지할수 있다.세포 성장 단계에서 pH 5.0-6.0을 유지하고 유도 발현 단계를 3.0-5.0으로 조정하는 정확한 pH 제어는 효모 세포 내 효소의 활성을 유지하고 세포의 정상적인 성장과 대사를 촉진하는 동시에 외원 단백질의 분해를 줄이고 단백질의 생산량과 질을 향상시키는 데 도움이 된다.

용산소 수준의 제어도 발효 탱크의 핵심 기능 중 하나입니다.비적효모는 발효과정에서 용산소에 대한 수요가 비교적 높으며 발효탱크는 합리적인 통기시스템과 교반장치를 통해 용산소농도가 시종 > 20% 수준을 유지하도록 확보한다.통기시스템은 발효액에 공기나 산소를 균일하게 통하게 할 수 있고, 교반장치는 끊임없는 교반을 통해 산소를 발효액에 충분히 분산시켜 산소의 전달효율을 높이고, 비적효모가 서로 다른 성장단계에서 산소에 대한 수요를 만족시키며, 그 대사활동의 정상적인 진행을 보장하며, 나아가 외원단백질의 고효율 표현을 촉진한다.

교반과 통기계통의 협동작용은 또 발효액중의 영양물질이 균일하게 분포되도록 보장하여 국부적인 영양결핍이나 과잉상황이 나타나지 않도록 함으로써 매개 필적효모세포가 모두 량호한 영양환경에서 생장할수 있도록 할수 있다.이와 동시에 발효탱크의 밀봉성능도 매우 중요하다. 이는 외계의 잡균의 오염을 방지하고 필적효모의 발효과정의 순정성과 안정성을 확보하여 염균으로 인한 발효실패나 산물의 질저하 등 문제를 피면할수 있다.

금유생공의 발효탱크 제품은 바로 이러한 관건적인 수요에 기초하여 설계하고 제조한 것으로 선진적인 온도제어, pH조절, 용산소제어 및 고효율의 교반과 통기시스템을 가지고 있어 비적효모의 발효에 최적화된 환경조건을 제공할 수 있으며 사용자가 효율적이고 안정적인 비적효모의 발효생산을 실현할 수 있도록 도울 수 있으며 실험실 소시험단계든 공업 대규모 생산에서든 모두 발휘할 수 있는 성능을 발휘하여 서로 다른 사용자들이 비적효모에 대한 각종 발효기술을 왕성하게 발전시킬 수 있다.우리는 비적효모의 연구동태와 응용수요에 지속적으로 관심을 돌리고 발효탱크의 설계와 제조기술을 끊임없이 최적화하고 혁신하여 발효탱크의 성능과 안정성을 제고하고 비적효모의 발효생산에 더욱 선진적이고 능률적인 설비지원을 제공하여 생물기술산업이 더욱 휘황한 미래로 나아가도록 공동으로 추진할것입니다.

금비생공 발효 탱크 소개
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