발효 탱크에서 대장균을 배양할 때는 대장균의 생장 수요와 생산 목적에 따라 최적화된 특정 발효 배지를 사용하는 것이 일반적이다.다음은 흔히 사용하는 발효배지 및 그 조제법이다. 대장균이 흔히 사용하는 발효배지는 주로 다음과 같은 몇가지를 포함한다.

1. LB 배양기(Lysogeny Broth)

LB배지는 대장균의 성장과 유지, 대규모 배양에 적합한 상용 대장균 배지다.

주성분:

·펩톤 (Tryptone): 10 g/L

·효모 추출물(Yeast Extract): 5 g/L

·염화나트륨(NaCl): 10g/L

특징:

·영양이 풍부하여 대장균이 빠르게 성장하기에 적합하다.

·글리세린을 첨가하여 고체 배양기를 만들 수 있다.

2. TB 배양기(Terrific Broth)

TB 배지는 LB 배지보다 더 많은 영양분을 함유하고 있어 고밀도 발효에 적합하다.

주성분:

·펩톤 (Tryptone): 12g/L

·효모 추출물(Yeast Extract): 24g/L

·글리세롤(Glycerol): 4 mL/L

·인산 수소 칼륨 (KH2PO4): 12.54 g/L

·인산이수소칼륨(K2H2PO4): 8.56g/L

·염화암모늄(NH4Cl): 3.4g/L

특징:

·고밀도 세포 배양에 적합한 더 높은 영양소를 제공한다.

·단백질 발현과 대규모 생산에 많이 쓰인다.

3. SOB 배양기:

대장균 단백질 발현에 적용돼 단백질 산출량을 높일 수 있으며 SOC 배양기 조제에도 쓰인다.

주성분:

·2% 펩톤

·0.5% 효모 추출물

·10mM NaCl

·2.5 mM KCl

·10 mM MgCl2의

·10mM MgSO4

·pH 7.5

특징:

·성분이 더 복잡하고 영양이 풍부하며 질소 함량이 높아 분자생물학 실험에 적합하다.

4. SOC 배양기:
주로 대장균 감수성 세포의 제조와 전환에 사용되며, 전환 효율을 높일 수 있고 단백질 표현에도 적용된다.

주성분:

·2% 펩톤

·0.5% 효모 추출물

·10mM NaCl

·2.5 mM KCl

·10 mM MgCl2의

·10mM MgSO4

·20 mM D- 포도당

·pH 7.5

특징:

·SOB 배지에 포도당을 추가해 직접적인 탄소원을 제공해 대장균 성장에 유리하다.

5. M9 배지

M9 배지는 영양결핍형 균주 배양과 같은 특정 실험 요구에 일반적으로 사용되는 기본 배양기입니다.

주성분:

·葡萄糖 (포도주): 4 g/L

·염화 암모늄 ((NH4Cl): 1 g/L

·염화나트륨(NaCl): 0.5g/L

·인산수소 칼륨(KH2PO4): 3g/L

·인산이수소나트륨(Na2H2PO4): 6.78g/L

·황산 마그네슘(MgSO4): 0.241 g/L

·염화칼슘(CaCl2): 0.011 g/L

특징:

·영양성분은 비교적 간단하여 기초연구나 영양조건을 엄격히 통제해야 하는 실험에 흔히 사용된다.

6. 2xYT 배양기

2xYT 배지는 LB 배지의 변종으로 더 높은 영양성분을 함유하고 있어 고밀도 배양에 적합하다.

주성분:

·펩톤 (Tryptone): 16 g/L

·효모 추출물(Yeast Extract): 10g/L

·염화나트륨(NaCl): 5 g/L

특징:

·영양이 풍부해 고밀도 대장균 배양에 적합하다.

보충물:

대장균이 발효되는 과정에서 다음과 같은 보충물을 첨가해야 할 수도 있다.

·항생제: 항성 균주를 선택하는 데 쓰인다.

·유도제: IPTG와 같이 재조합 단백질의 발현을 유도하는 데 쓰인다.

·미량 원소와 비타민 용액: 세포의 성장을 지원하는 데 쓰인다.

발효과정에서 배지의 조제방법과 조건 (예를 들면 pH, 온도, 용해산소 등) 은 구체적인 실험목적과 생산요구에 따라 조정해야 한다.례를 들면 고밀도발효를 진행해야 할 경우 황산마그네슘의 양을 증가시켜야 하며 보충재료에 적합한 효모침분을 첨가하면 발효주기를 높일수 있고 황산암모늄을 첨가하면 균농도를 높일수 있다.발효과정은 엄격한 무균조건하에서 진행되여야 하며 발효과정의 제반 매개 변수를 감시하여 발효가 예기한 결과에 도달하도록 확보해야 한다.

대장균 발효 공정 개발 프로세스에는 일반적으로 다음과 같은 몇 가지 핵심 단계가 포함됩니다.

1. 균주의 구축:

우선 유전자공학 노선 설계, 균주 개조와 선별, 요병 조건 모색 등 우수한 균주를 선택해야 한다.

2. 배양기의 최적화:

배양기는 대장균 발효 공정의 중요한 구성 부분이다.서로 다른 균주와 제품의 요구에 따라 배지 조제법을 조정해야 하며, 배지 성분에 대해 비교적 잘 알고 있으며, DOE 선별을 진행할 수 있으며, 주요 성분에는 탄소원, 질소원, 무기염과 성장인자 등의 배합 비율이 포함된다.

3. 공정 매개 변수 최적화와 제어:

온도: 대장균이 성장하는 가장 좋은 온도는 보통 37 ℃ 이지만 발효 목적과 균종 특성에 따라 온도 범위를 적절히 조절 할 수 있습니다.

pH 값: 대장균이 성장하기에 가장 적합한 pH 값은 7±0.2이다.발효 과정 중에는 산성 알칼리 보충재 전략을 통해 발효액의 pH 수치를 안정적으로 유지해야 한다.

용존산소(DO): 대장균의 임계 용존산소 농도 범위는 20~30%이다.용산소가 부족하면 아세트산이 축적되어 균체의 생장에 영향을 줄 수 있다;과용산소는 산소중독 현상을 일으킬 수 있다.그러므로 교반회전속도, 통기량 등 매개 변수를 조절하여 용산소수준을 통제해야 한다.

보충재 전략: 보충재 분할식 발효를 선택하여 대장균의 고밀도 발효를 실현하고 더 많은 바이오매스를 얻는다.재료 보충 과정 중 발효액 중의 양분 소모 상황을 실시간으로 모니터링하고 재료 보충 공정의 개발을 진행하며 재료 종류와 재료 보충 시간과 재료 보충량을 확정해야 한다.

발효 공정 개발 과정에서 minitab 또는 JMP와 같은 유사한 소프트웨어를 사용하여 DOE의 실험 방법을 설계하여 실험 과정을 가속화하고 더 좋고 안정적인 공정 매개변수를 찾을 수 있습니다.