기질효과(matrix effect/matrix interference)는 샘플의 다른 물질이 목표 분석물을 검사하는 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것을 말한다. 혈청, 혈장, 조직 균장 등 생물 샘플에 대한 면역 검사에서 가장 흔히 볼 수 있다. 왜냐하면 이런 샘플의 많은 성분인 탄수화물, 단백질, 인지, 대사물 등은 항체와 그 목표의 결합을 방해하거나 신호를 억제하거나 증강시키거나 정확한 정물 분석에 영향을 미치기 때문이다.

임상 연구의 생물 분석에서 기질 간섭은 더욱 큰 도전이다. 예를 들어 혈청과 혈장에서 이미 여러 가지 유형의 간섭이 발견되었는데, 보통 류머티즘 인자, 기이성 항체 (불명확한 항원에 대한 항체, 낮은 친화력과 약한 결합을 나타냄), 인간 항동물 항체 (HAAAA, 면역 체계가 동물 항체와 접촉할 때 발생하는 높은 친화력 항체, 민감성 항체, 백질성 단백질 및 기타 항체, 민감성 항체 분석, 백질성 단백질 검사 불감, 백질성 항체, 백질성 단백질 검사 등의 직접적인 영향을 초래한다.]

기질효과를 줄이는 가장 기본적인 방법은 시료희석이지만 전제는 희석후 분석물의 수준이 여전히 선형범위내에 있으며 희석은 검측민감도에 영향을 미치므로 통용되는 책략이 아니다.완충액 pH와 이온 강도를 최적화하는 것도 비특이성 상호작용을 줄이는 데 도움이 된다.그러나 다른 교란 극복 전략에는 적절한 동물 혈청 칵테일로 인간 항쥐 항체 (HAMA) 를 수동적으로 제거하는 것과 같은 교란 분자와 결합하거나 경쟁하는 물질을 첨가하는 것, 기이성 항체 억제제 (HBR) 와 면역 글로불린 억제 시약 (IIR) 또는 Fc 세그먼트가 부족한 F (ab′) 2 또는 단일 체인 세그먼트 (scFv) 를 포획/검사 시약으로 사용하는 것 등 대부분의 노동 시약에 대한 실용적인 방법은 포획 방법의 값비싼 것이 아닙니다.

배합체 결합 시험(ligand binding assay, LBA) 기반 면역 검사의 경우 부화 시간을 줄이거나 검사 시약이 기질과 접촉하는 시간이 기질 효과를 극복하는 효과적인 수단 중 하나로 입증되었다[4].Gyrolab®미세 흐름 제어 CD에 친화적 기둥 흐름 관통 모드를 구현함으로써 시약과 기질의 접촉 시간을 최소화하고 기질 간섭을 최소화했다.Bristol-Myers Squibb사의 Shannon D Chilewski 등 [5] Gyrolab 활용®플랫폼은 임상 전 PK 연구에서의 기질 교란 문제를 해결했다.

이 사례는 어떤 PEG화 항체에 대한 PK 검사에서 인간 항동물 항체(HAAA)에서 유래한 기질 간섭이 관찰된 것이다.약물 발견 단계에서 1회 투약량 증가(single ascending dose, SDA) 연구를 지원하기 위한 검출 방법은 전기화학발광검사(ECL) 기반 방법으로 표적분자를 포획시약으로, 염소 항Vk항체를 검출시약으로, 시료 희석도는 50배, 정량 하한선인 LLOQ는 80ng/mL이다.

그러나 검색 단계에서 개발 단계로 전환할 때는 더 낮은 감지 감도와 정확성과 정확도를 동시에 유지하거나 향상시켜야 하며, 다음 세 가지 이유로 ECL 검출 방법인 80ng/mL의 LLOQ는 다음 단계의 연구를 지원하기에 적합하지 않습니다.

1 개발팀은 이 약물의 낮은 용량에서의 반감기 특징에 관심을 가지고 있으며, 현재의 검사 방법을 그대로 사용한다면 결과는

2 수용체 점유율 EC50이 78ng/mL일 때 순환 중 약물 농도를 측정하기를 희망한다.

3 면역원성이 나타난 상황에서 항약항체는 약물을 제거하는 작용을 하여 순환중의 약물수준을 낮출수 있기에 이 검사방법은 비교적 낮은 선량하의 약물정량에 대해 진일보 제한을 받을수 있다고 추정한다.

　LLOQ를 요구 사항인 30ng/mL로 확장하고 감지 감도를 높이기 위해 연구팀은 Gyrolab 채택을 모색했습니다.®플랫폼과 새로운 시약을 조합하여 제한된 시간 내에 새로운 검사 방법을 신속하게 개발한다.

일단 Gyrolab에서.®에서 포획 및 검사 시약 조합을 선별하여 염소 다크론 항약 항체를 포획 시약으로, 생쥐 항특별형 단항을 검사 시약으로 하였는데, 이 조합은 포획 항체 농도가 100µg/mL, 검사 항체 농도가 2500ng/mL로 가장 좋은 성능을 보였다.Gyrolab 사용® Bioaffy 200 CD(샘플 부피 200nL) 및 표준 Gyrolab®3단계(포획-분석물-검측)로 분석하고 시료 희석 MRD는 2.

PBS-T는 희석 완충액(PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20)으로 시료가 2배로 희석된다.3일 동안 6번의 CD 테스트를 실시했다.각 CD에는 표준 커브와 6 레벨 QC 샘플의 4 반복이 포함됩니다.표준 커브 범위는 30-2000ng/mL이고 앵커 포인트는 2500ng/mL입니다.QC 시료는 100% 인혈청에서 125배 희석한 뒤 측정 범위에 농도가 떨어지도록 검사 완충액으로 2배 희석한다.표 1은 모든 결과가 양호한 측정 정확도와 정확도를 보였다.

각각 PBS-T 완충액과 Gyros 특허의 Rexxip H 완충액(Gyros) 희석 시료로 평행 비교한다.검사 방법에는 생쥐 단항이 포함되어 있기 때문에 인간 항쥐 항체 HAMA는 잠재적 교란원이고 Rexxip H 완충액은 기성 항체를 중화하는 성분이 포함되어 있기 때문에 Rexxip H를 사용하여 희석하면 기질 교란 신호를 억제할 수 있어야 한다.

20개의 혈청 샘플(정상인 10개의 혈청 NHS1-10, 환자군 10개의 혈청 DPS1-10)을 30ng/mL의 LLOQ 농도로 약물을 섞어 분석했고, 20개 샘플도 모두 기준치 없는 분석을 했다.검수 기준: 80% 의 가표 샘플은 공칭 농도 ± 25% 의 편차 범위 내에서 회수해야 하며, 모든 미가표 샘플의 회수는 LLOQ보다 낮아야 한다.결과(표2)에 따르면 정상인 혈청 샘플은 Rexxip H 완충액을 사용하여 희석한 후 목표 수용 기준을 충족했다.정상인 혈청 2호 시료의 경우 PBS-T를 사용한 회수율이 252.6%, Rexxip H를 사용한 회수율이 25% 이내라는 것은 Rexxip H 완충액이 이 시료의 기질 간섭을 매우 잘 제거했다는 것을 의미한다.이 중 두 질병의 혈청 샘플은 샘플을 추가하지 않았을 때 Rexxip H 완충액을 사용하더라도 역산 농도가 32~35ng/mL이다.따라서 질병군에 대한 연구 설계에서 LLOQ를 40ng/mL로 설계하는 추가 실험을 반복해야합니다.

요약:

전기화학발광(ECL) 검출방법(LLOQ 80ng/mL)을 Gyrolab으로 옮겼습니다.®플랫폼에서 최적화된 항체 쌍과 완충액을 사용하여 민감도가 더 높은 검사 결과를 생성하고 LLOQ를 30ng/mL로 개선하여 미래 연구의 요구를 충족시킬 수 있습니다.

Gyrolab® 플랫폼의 친화적인 기둥 흐름 패턴 및 특허된 Rexxip 완충액은 기질 효과로 인한 데이터 정확도와 감도의 저하를 최대한 줄일 수 있다.

Gyrolab의 기저 효과 감소에 대한 다른 사례를 이해하려면 원문 읽기를 클릭하여 연락하십시오.

참조 문서:

[1].Selby C. Immunoassay에 대한 개입.앤 클린바이오케마36(Pt 6), 704–721 (1999).

[2].아나 I. 바르보사, 누노 M. 레이스.항체 표면 커버리지는 Microfluidic Capillary Immunoassays에서 매트릭스 개입을 구동합니다.ACS 센서 2021 6 (7), 2682-2690.

[3].Williams K, Erickson R, Fischer SK. microfluidic immunoassay 기술을 사용하여 임상 약동학 분석에서 질병 특정 매트릭스 효과를 극복.Bioanalysis, 9(16), 1207-1216 (2017).

[4].살루메 K. 피셔.리간드 결합 분석 기술: 바이오 분석 과제에 맞는 도구를 맞추기.https://www.bioanalysis-zone.com.

[5].Shannon D Chilewski는새로운 시약 및 기술의 사용을 통해 리리리리리간드 결합 분석에서 매트릭스 효과를 해결하기.Bioanalysis (2014) 6(8), 1059-1067.