종 특이성 단백질 - 단백질 상호작용이 효모 20S 단백질 효소체의 인원화를 제어한다
날짜:2025-10-28읽기 :0
우리는 효모 단백질 효소체를 인원화하기 위한 높은 통량의 파이프라인을 개발하여 대규모 Hs 베타 2c 돌연변이 문고를 생성하고 이를 선별하여 효모 베타 2 (ScPup1) 를 보충하여 제거했다.ScPup1을 대체할 수 있는 변이에는 베타 2c C 끝부분과 인접한 베타 3 아기 사이의 상호작용에 영향을 주는 최대 베타 2c 단백질 수해 활성인 국소 단백질-단백질 상호작용(PPIs)에 영향을 주는 변이가 포함된다.인간 베타 2c의 전장 꼬리를 ScPup1의 전장 꼬리와 교환하면 상호 보완이 가능하다.또 인간 베타3를 제공하면 야생형 인간 베타2c가 효모 베타2를 대체할 수 있다.뜻밖에도 효모 프로테아제는 촉매 활성 차단 전구체가 자동으로 가공되는 HsPSMB7-T44A 변체를 가지고 있어 가능하다. 이는 완전한 전펩타이드가 후기 조립 중간체를 안정시켰다는 것을 보여준다.이에 비해 비슷한 수식은 인간 베타 2i (HsPSMB10), 면역 단백질 효소체 아기와 효모 베타 2의 동원물로 효모에서 상호 보완이 이루어지지 않는다. 이는 인간 면역 단백질 효소체 핵심 조립에서 서로 다른 상호작용이 관련되어 있음을 보여준다.전반적으로 말하면우리의 데이터는 특정 PPIs가 거대한 진화 거리에서 기능의 대체 가능성을 제어하는 역할을 보여줍니다.
효모가 서로 보완하는 인간 유전자 변이를 선별하는 새로운 고통량 파이프
저자가 이전에 효모 유전자를 식별하는 데 사용한 인간 유전자 대체형 변이의 선별 전략이 성공했지만, 이 전략은 번거롭고 2개의 억제자 (Kachroo 등, 2015년) 만 감정했다.이 기술은 인공적으로 균락을 분리한 후에 진행해야 한다사분체분리하고 억제자를 감정하려면 수백 개의 효모 균락을 인공적으로 선별해야 한다.따라서 저자는 자동 하이패스 방식으로 억제 하위 입자를 선별하는 새로운 프로세스를 개발했다 (그림 1a).
저자는 특히 비상호보완적인 인간 베타 2c(HsPSMB7) 단백질 중 하위 돌연변이를 억제하는 구성형 발현의 단백질 효소체 아기를 선별하는 데 집중한다.이 접근 방식은 대폭 단축된 시간 내에 대규모로 오류 없이 필터링할 수 있습니다.실험은 96 공판 형태로 수행되었으며 합성 유전체 배열(SGA는) 또는 MM 선택법은 단배체 특이성 돌연변이를 분리하여 사분체 분리를 할 필요가 없다(Pan 등, 2004년;쿠즈민 등, 2016년).5-FOA를 사용하여 선택한 입자 의존성 측정을 통해 상호 보완 작용이 URA3 기반 입자에 있는 변이 인간 유전자와 관련이 있음을 확인했다.이 전략을 이용하여 저자는 HsPSMB7 유전자에서 여러 개의 대체 가능한 억제 돌연변이를 얻는 데 성공했다.논문 전체에서 저자는 항상'기능 교체','교체 가능성'또는'교체 가능성'이라는 용어를 사용하여 인간의 유전자나 그 변이체가 효모의 동원 유전자의 기능을 보상하는 능력을 가리킨다.이 필터링 프로세스는 여러 고려 사항을 기반으로 개발되었습니다.야생형 인간 PSMB7(베타 2c)은 동원된 효모 베타 2 유전자 ScPUP1을 대체할 수 없다는 점이 효모 유전자를 선택적으로 제거할 때 관찰된 치사 표형에서 증명된다(그림 1b, 보충 그림 1b)(카헤로 등, 2015년).이에 비해 인간 유전자 (또는 그 변체) 가 숙주 유전자의 기능을 성공적으로 대체하면 이 균주가 성장할 수 있어 기능 대체의 간단한 검사 지표로 활용된다.오류율이 높은 PCR 정책은 URA3 마커가 있는 효모 발현 캐리어에 HsPSMB7 돌연변이 유전자 라이브러리를 생성하여 각 유전자에 평균 1~4개의 돌연변이가 있습니다 (그림 1a).
어떤 돌연변이의 PSMB7 등위 유전자가 동원 효모 유전자 삭제로 인한 치사성을 보완할 수 있는지 확인하기 위해 저자는 돌연변이 유전자 라이브러리를 효모 2배체인 HetKO PUP1/pup1 ⑥:: kanMX 균주 중 (Pan 등, 2004년) 으로 전환한다.전환 시나리오는 서로 분리 된 수천 개의 효모 균락을 얻기 위해 확장되었으며 각 균락은 다른 PSMB7 돌연변이 유전자 입자를 가지고 있습니다 (그림 1b).QPix 460을 사용하여 수천 개의 균락을 자동화하여 96홀 형식으로 사전 포자화 GNA 배지에 접종하고G418은선택법은 kanMX 태그가 있는 pup1 을 필터링합니다.포자가 형성되면 MM 배양기 (Leu, Arg, His, Ura, CAN 제외) 에서 서로 다른 인간의 PSMB7 등위 유전자를 가진 생존 가능한 pup1 을 선택할 수 있다::kanMX 단배체 효모 포자 (G418이 존재하는 경우) (그림 1c, 하단 패널).포자 형성 효율의 내부 대조로 저자는 야생형 PUP1 단배체 포자가 MM 배양기(G418 제외)에서 자라는 상황(그림 1c, 상단 패널)도 테스트했다.선별 결과 MM + G418 배지에서 자라는 19 개의 균락 (그림 1d의 대표적인 이미지) 은 상호 보완적 인 인간 PSMB7 변형을 가지고 있을 수 있습니다.그런 다음 이러한 단배체 억제 돌연변이를 테스트하여 억제가 입자에 있는 인간 돌연변이 유전자를 가지고 있기 때문인지 확인합니다.5-FOA에 대한 결핍 성장 (이것은 URA3 유전자를 억제합니다) 에 따라 효모 세포의 입자 의존성을 테스트합니다.이 19개의 억제 돌연변이 중 7개는 5-FOA 배지에서 생존할 수 없으며, 이는 이들 균주의 인간 유전자 변형이 생존에 필수적임을 보여준다 (그림 1d).
그림 1: 대체 능력을 갖춘 인간 유전자 억제제를 효모에서 선별하는 데 사용되는 높은 통량 자동화 프로세스.a) 워크플로우는 PCR(염기당 0-4개의 돌연변이) 오배를 통해 인간 유전자 돌연변이 라이브러리를 생성하고 선별하는 과정을 보여준다.변이 풀은 발현 캐리어 (CEN6, URA3) 로 복제되어 효모 잡합 2배체로 전환되어 PUP1/pup1 ⑥::kanMX 주를 두드린다.b) 돌연변이 라이브러리의 전환 규모가 커지고 (4배) 혼합물이 QTray에 도포됩니다.QPix 460 균락을 통해 로봇(최대 1000개 균락)을 골라 단일 균락을 골라내고 GNA가 풍부한 예포자 형성 배지에 샘플을 찍은 뒤 96공판 형식에서 포자 형성을 한다.c) 각 포자 형성 혼합물은 G418이 함유된 MM 배지에 샘플링되어"효모 유전자가 결핍하고 인간 유전자가 존재한다"는 조건을 나타내며, 대체 능력이 있는 인간 유전자 변형을 선별하는 데 사용된다.또는 G418을 첨가하지 않은 포자형성혼합물인"효모유전자가 존재하거나 결핍하고 인류유전자가 존재한다"는 조건으로 야생형단배체효모세포가 생장하는것을 허용하여 포자형성효률의 대조로 삼아야 한다.간편하게 하기 위해, 우리는 이러한 조건을 각각"함유 (+) G418"이라고 부르며,"효모 유전자 결핍"조건과"함유 (-) G418"을 표시하여"효모 유전자 존재"조건을 표시한다.가능한 억제자는 G418을 함유한 MM 배지에서 성장하는 반점으로 나타나며, G418을 함유하지 않은 MM 배지 조건에서의 성장 상황과 유사하다.d) G418을 함유한 MM 배지에서 자라는 균락(효모 유전자가 결핍하고 인간 유전자의 존재 조건)은 더 나아가 5-플루오레시딘(5-FOA)을 사용하여 URA3 입자에 대한 입자 의존성 측정을 선택하여 분석한다.대표적인 예로 인간의 유전자 억제자를 가진 효모 균주가 5-FOA 배지에서 자라지 않는 것은 입자 의존성 (억제자 1, 위 사진) 을 나타내거나 5-FOA 배지에서 자라는 것으로 입자 독립성 (억제자 2, 아래 사진) 을 나타낸다.마지막으로 인간 유전자 억제자를 가진 각 입자를 순화하고 재테스트하여 기능 대체 가능성과 입자 의존성을 확인한 후 Sanger 시퀀싱을 진행하여 인간 유전자의 돌연변이를 감정한다.
만약 사람 베타3도 존재한다면 야생형 사람 베타2c는 효모균 단백질 효소체와 결합할 수 있다
이상적인 상황에서 효모균을 인원화하여 기능으로 인류유전자를 표징하면 효모균중의 야생형인류등위유전자를 리용하게 된다.그러나 억제자 선별 및 c 말단 꼬리 교환 데이터는 인간 베타 2c가 효모 CP에 올바르게 조립되기 위해 인접 효모 아키와 상호 작용하는 돌연변이, 특히 Sc 베타 3가 필요하다는 것을 보여줍니다.따라서 이러한 인간 특이성 아기의 상호 작용을 복원하는 전략은 야생형 HsPSMB7을 효모 프로테아제에 통합시킬 수 있습니다.이 가설을 검증하기 위해 저자는 야생형 인간 베타 2c가 균주 속 효모 대응물을 기능적으로 대체할 수 있는지 묻는다.저자는 효모의 ScPUP1(베타2)과 ScPUP3(베타3) 유전자를 표적으로 삼는 크리스퍼-카스9 기반 방법을 개발했다.Cas9-sgRNAScPUP1 또는 Cas9-sgRNAScPUP3을 나타내는 입자 전환 효모는 사망에 이를 수 있습니다.인간의 유전자가 효모를 기능적으로 대체할 수 있다면동원 유전자그렇다면 효모 비트 5'와 3'의 말단 동원 서열에 대응하는 인간 유전자 복원 템플릿을 공전시켜 생존하는 세포를 얻을 것으로 예상된다.
저자는 먼저 야생형 HsPSMB7이 ScPUP1을 대체하여 제자리 유전자 위치에서 역할을 할 수 있는지 테스트했지만 예상대로 생존 균락을 얻지 못했다 (그림 2a).그러나 T44A 또는 S214G 돌연변이를 가진 HsPSMB7 변형을 사용하여 수정 템플릿은 효모의 PUP1 유전자를 기능적으로 교체 할 수 있습니다 (그림 2b).앞서 저자는 효모의 베타3(PUP3) 유전자가 입자에 발현할 때 인간 동원유전자(HsPSMB3)에 의해 기능적으로 대체될 수 있다는 사실을 입증했다(Kachroo 등·2015년).HDR 기반 CRISPR-Cas9 전략(아흐메토프 등·2018년)을 사용해 저자는 해석형 효모의 베타3 유전자(그림 2c)를 인간의 베타3(HsPSMB3) 유전자로 교체하는 데 성공했다.이에 따라 효모의 베타 2 아기는 인간의 베타 3 아기를 효모 단백질 효소체 핵심 부위로 모집할 수 있지만, 인간의 베타 2 c 아기는 효모의 베타 3 아기와 함께 이 역할을 할 수 없다.먼저 인간화된 베타3 효모 균주를 사용했으며, 크리스퍼-카스9 기반 유전자 편집 기술은 이제 효모 속 베타2를 야생형 인간 베타2c(HsPSMB7) 유전자로 교체할 수 있게 됐다.2인용 Hs 베타 2c-Hs 베타 3 효모 균주는 생존할 수 있으며, 이 점은 비트 특이성 PCR과생거 서열 분석검증되었습니다 (그림 2d).
따라서 인접한 인간 아기, 즉 인간 베타 3를 제공함으로써 일반적으로 상호 보완적이지 않은 인간 베타 2c는 이제 효모 단백질 효소체에서 작용할 수 있습니다.그러나 효모에 인간 베타 3를 제공하면 효모 베타 2가 Hs 베타 2i를 통해 상호 보완되지 않습니다.정량 생장 측정은 공정 균주의 적정 적응성 결함을 나타냈다.인간화된 Hs베타 2c-S214G 균주는 23°C에서 저온으로 민감한 생장 결함을 보이는 반면 인간화된 Hs베타 2c-T44A 균주는 23°C와 37°C에서 야생형 균주보다 생장 속도가 느리다.또한 인간화된 Hs베타3 균주는 야생형 효모와 비슷한 양상을 보이지만 인간화된 Hs베타2c-Hs베타3 균주는 23 °C에서 저온으로 민감한 표형을 나타내며 액체 배양에서 30 °C에서 성장 속도가 느리다.
그림 2: 야생형 인간 베타 2c와 인접한 인간 베타 3를 동시에 제공하면 효모 동원물의 기능 대체를 실현할 수 있다.a) pCas9-sgRNAScPUP1과 인간 야생형 PSMB7 유전자 복원 템플릿을 PCR 조각으로 공전시켜 생존한 인간화 균주를 얻을 수 없다.b) 그러나 pCas9-sgRNAScPUP1과 인간 PSMB7-T44A 또는 PSMB7-S214G 유전자 변형을 복원 템플릿으로 공동 전환하면 유전자 그룹이 인간 유전자 변형의 생존 효모를 통합하는 것을 얻을 수 있다.c) pCas9-sgRNAScPUP3와 인간 야생형 PSMB3(베타3) 유전자 복원 템플릿을 PCR 조각으로 전환해 생존한 인간화 베타3 균주를 얻을 수 있다.d) 퍼스널 베타3 균주를 배경으로 pCas9-sgRNAScPUP1과 인간 야생형 PSMB7 유전자를 복원 템플릿으로 공전시켜 야생형 인간 베타2-베타3의 효모를 통합한 게놈을 얻을 수 있다.치메라X 소프트웨어를 사용해 7개의 아기로 구성된 효모 베타-프로테아제 코어링 1개(PDB-1RYP)를 선보였다.대체 가능한 아키는 노란색, 대체 불가능한 아키는 파란색으로 표시됩니다.대표 배양접시는 30°C에서 3~5일 배양한 뒤 선택배지에서 자란 균락을 보여준다.
