하나,초여과 원심관원심 파라미터 최적화

회전 속도와 시간

첫 번째 원심분리는 권장 회전 속도의 70% (예: 3000 × g 원심분리 10분) 로 시작하여 유속을 관찰한 후 4000 × g로 단계별로 조정하되 필터 내성 한계를 초과해서는 안 된다.

일반적인 처리 시간은 절단 분자량 (MWCO) 과 샘플 부피에 따라 10-30 분입니다.

온도 제어

원심분리기는 4 ℃ 로 예냉하여 열변성 흡착을 줄여야 한다.저온 환경은 필름 사용 수명을 연장할 수 있지만 농축 시간이 길어질 수 있다는 점에 유의해야 한다.

가속도와 균형

원심 가속도를 최하단으로 조절하여 대막의 압력을 줄이다.

페어링된 울트라필터의 품질이 무게 중심과 균형을 이루고 필터의 배치 위치와 방향이 일치하여 원심 분리 과정에서 흔들리거나 손상되지 않도록 합니다.

2. 회수율 향상 전략

필터 선택 및 사전 처리

목표 분자량에 따라 MWCO가 목표 분자보다 2~3배 작은 초여과막을 선택한다.예를 들어, 목표 단백질 분자량이 35kDa일 경우 10kDa 차단 분자량의 초여과관을 선택합니다.

새로 구입한 초여과 원심관의 초여과막은 미량의 글리세린이 함유되어 있어 사용하기 전에 순수한 물이나 완충액에 담가 냉장고에 넣어 10분 동안 예냉해야 한다.그 후 순수한 물을 붓고 초여과관을 얼음 위에 올려 2-5분 동안 예냉한다.

샘플 처리 및 샘플링

시료는 미리 0.22μm 여과막으로 여과해 미세먼지가 초여과막을 막지 않도록 했다.

샘플을 초여과관에 천천히 넣고 액면은 최대 표시선을 초과하지 않는다.샘플을 추가할 때는 조작이 가벼워 막 구조를 파괴하지 않도록 해야 한다.

농축과 세척

원심 분리 과정 중 5분마다 잠시 멈추고, 이액총으로 부드럽게 절류층을 불어 대분자가 쌓여 농차 극화층이 형성되는 것을 방지한다.

캡쳐 볼륨은 원래 샘플 양의 1/10 ~ 1/20로 제어됩니다.농축 배수가 너무 높으면 단백질이 모이기 쉬우므로 초여과 도중에 완충액을 첨가하여 치환하여 단계별로 농축할 수 있다.

끈적끈적한 샘플 (예를 들어 글리세린이나 사탕수수 설탕 함유) 에 대해서는 회전 속도를 10~20% 낮추고 원심 분리 시간을 연장해야 한다.

재활용 작업

원심을 떠난 후, 큰 분자는 상층에 남아 있고, 작은 분자와 용제는 막을 통해 하층으로 들어간다.외관 여과액은 소분자 물질과 용제이다.내관 액체는 대분자 물질이다.

대분자물질을 수집하려면 외관을 따로 취하고 내관은 1000×g 원심분리를 1~2분 거꾸로 한다.

3. 일반적인 문제와 해결 방안

단백질이 새거나 검출되지 않음

원인: 여과막의 선택이 부당하고 원심매개변수가 적합하지 않으며 견본의 초기농도가 너무 낮은 등이다.

솔루션: 적절한 MWCO 필터를 다시 선택하고 원심 분리 매개변수를 조정하여 샘플의 초기 농도가 25 μg/ml보다 큰지 확인합니다.

막이 막히거나 유속이 너무 느리다

원인: 샘플에 과립물 과다, 여과막 오염 등.

솔루션: 샘플을 미리 필터링하고 정기적으로 필터를 세척 또는 교체합니다.막이 막힌 것을 발견하면 0.1M NaOH에 1시간 담가 순수한 물로 세 번 더 씻는다.

낮은 회수율

원인: 여과막의 흡착성, 조작 부적절 등.

솔루션: 1% BSA로 30분 전에 필터를 닫아 비특이성 흡착을 줄입니다.조작할 때 가볍고 부드러워 막 구조를 파괴하지 않도록 주의해야 한다.

초여과 후 절류액 이 침전 되다

원인: 단백질 농도 과다, 버퍼 부적합 등.

솔루션: 여러 개의 필터로 동시에 필터링하여 농도를 낮춥니다.단백질이 침전되지 않을 때까지 다른 버퍼를 바꿔.침전의 경우 8M 요소로 녹인 후 다시 원심분리할 수 있다.

4. 유지보수와 정비

세척과 소독

한 번에 사용하는 초여과 원심관은 사용 후 바로 버린다.

재사용이 필요하면 사용한 초여과관은 순수한 물로 5회 반복 세척한 뒤 0.1M NaOH로 1~2시간 담근 뒤 20% 에탄올로 세척하고 초순수 또는 완충액으로 3회 세척한다.일반적으로 5 회 이상 필터를 재사용하는 것은 권장되지 않습니다.

장기 보존

단기보존: 0.1M NaOH에 1~2시간 담그고 순수한 물에 3회 세척한 다음 75% 에탄올에 담그고 반드시 려과막을 습윤하게 유지하고 균이 자라지 않도록 해야 한다.

장기보존: 0.1M NaOH에 1~2시간 담그고 순수한 물에 3회 세척한 다음 20% 에탄올에 담그고 반드시 려과막을 습윤하게 유지하고 균이 자라지 않도록 해야 한다.