소개

단백질은 생물계통에서 매우 중요한 역할을 하며 생명에 필요한 각종 대사과정에 참여한다.그것들의 중요성으로 인해 그들은 제약과 같은 산업에 널리 사용되고 있으며, 이러한 산업에서는 항생제와 생물학적 제약과 같은 약물 개발과 식품 생산에 도움이 되며, 이러한 산업에서는 영양 보충제의 핵심 성분입니다.건강 관련 응용에서 예상되는 용도를 감안할 때 단백질 추출 과정에서 순도를 높이는 것이 중요하다.

여러 가지 사용 가능한 순화 방법 중 크로마토그래피는 단백질을 분리하는 데 유효하기 때문에 자주 채택된다.일반적으로 사용되는 기술은 이온교환, 소수상호작용, 친화, 반상과 겔여과크로마토그래프를 포함한다.반상 크로마토그래피는 이미 폴리펩티드와 소단백질 분리에서 가장 중요한 도구가 되었다.그것의 뛰어난 분리 능력 때문에, 폴리펩타이드가 아미노산 잔기 하나만 차이가 나도 종종 분리될 수 있다.또한 반상 크로마토그래피는 물 혼합물을 유동상으로 사용하기 때문에 이 방법은 물 함유 샘플과 호환된다.반상 크로마토그래피는 조사 연구 중인 불순물 검사나 치료제의 대규모 순화에서 불필요한 화합물을 제거하는 데 널리 사용된다.반상 크로마토그래피는 극성 유기용제를 유동상으로 사용하기 때문에 이 방법은 엄격한 조건을 견딜 수 있는 화합물에만 사용할 수 있다.이런 종류의 크로마토그래피는 보통 펩타이드와 작고 안정적인 단백질에 적용된다.이 단백질들은 순화된 후에 자발적으로 다시 접힌다.

반상 크로마토그래피는 Flash 또는 고효율 액상 크로마토그래피로 사용할 수 있습니다.이 두 가지 기술은 자주 사용되지만 목적은 다릅니다.Flash 크로마토그래피는 주로 많은 샘플을 충분한 해상도로 순화하기 위한 순화 전 단계로 사용되며, 고효율 액상 크로마토그래피는 업로드량이 낮은 조건에서 가장 높은 해상도(순도)를 얻는 것을 목표로 한다따라서 이 두 기술의 차이점은 고정상에 사용되는 재료 (서로 다른 입도), 크로마토그래피 기둥의 크기 (내경과 길이), 유동상의 유속에 있다.

표 1: Flash 스펙트럼과 고효율 액상 스펙트럼의 차이

단백질은 복잡한 분자로서 특정한 3차원 구조를 채택하고 아미노산 잔기와 주변 용제 간의 상호작용에 의해 결정된다.이 구조 접기는 수용액에서 유효한 크기를 설명하는 수동 반지름을 정의합니다.크로마토그래피에서 단백질이 고정된 상공극을 관통하는 능력은 분리효률에 직접적인 영향을 준다.크로마토그래피 매체의 비교적 큰 공경은 고정상에 더 잘 들어갈 수 있고 단백질 분리의 해상도를 높일 수 있다.고정상의 입자 크기도 단백질과 표면의 상호작용에 영향을 줄 수 있다.작은 입자는 더 많은 상호 작용 비트를 제공하여 더 뚜렷한 분리를 초래하지만 큰 입자는 접촉 면적을 제한하고 해상도를 낮춥니다.공극과 입자 크기를 최적화하는 것은 고효율 단백질 순화를 실현하는 필수 조건이다.

크로마토그래피 분리 과정에서 단백질의 행동은 용제의 pH 값에 따라 그 전하의 영향을 크게 받는다.단백질의 안정성을 유지하기 위해 일반적으로 완충 용액에서 순화하여 천연 구조를 유지합니다.경우에 따라 pH 값을 변경하는 것은 단백질의 전하를 변경하고 분리 효율을 높이는 효과적인 전략입니다.

실험 설비

시약과 재료

실험 절차

이 연구의 크로마토그래프는 다음과 같은 실험 조건에서 생성되었습니다.

표 3. 그라데이션 1

표4.경도2

표5. 경도3

이전 실험에서는 PrepPure C18WP(300Å) 기둥을 사용하고 10μm을 고정상으로 사용하면 최적의 단백질 분리가 가능하다고 밝혔다.그림 1은 샘플의 크로마토그래프로 PrepPure C18WP(300Å), 10μm를 사용하여 참고문헌과 유사한 그라데이션 아래(그라데이션 1:30%~90%, 10분 이상).참고 문헌과 달리 세척 순서에 따라 난포 샘플 단백질, 난포 적색 단백질, 용균 효소, 난포 트랜스퍼 단백질, 난포 백색 단백질만 관찰된다.이러한 차이는 샘플 제조에 사용되는 계란의 품질과 출처의 차이에 기인 할 수 있습니다.

* 조건을 분리하기 위해 우리는 목표 단백질의 해상도를 최적화하기 위해 여러 차례 실험을 진행했다.그림 2는 PrepPure C18WP (300Å), 10μm, 그라디언트 2: 10%, 20% 및 30%에서 얻은 크로마토그래프를 보여주며 이는 목표 단백질의 분리에 도움이 된다.

다음,그림 2의 실험 조건을 참고하여 공경과 입경의 영향을 연구하였다.

그림 3및그림 2동일한 조건의 크로마토그래프는 C18 비 WP(100Å)(PrepPure C18, 10μm)를 사용하여 공경의 영향을 연구한다.자외선 신호는 C18WP에 비해 앞의 두 피크의 해상도가 높아졌다는 것을 보여주지만, 낮은 흡광도와 ELSD 신호는 효과적인 분리가 일어나지 않았음을 보여준다.C18WP의 대공경(300Å)은 단백질이 입자를 관통하고 고정과 효과적으로 상호작용할 수 있도록 한다.이에 비해 PrepPure C18 (100Å), 10μm은 단백질이 입자의 외부 표면과만 상호 작용할 수 있기 때문에 분리가 불가능합니다.이러한 제한된 상호 작용은 흡착과 흡착 해제 사이의 균형 단계의 수를 감소시켜 분리 효율에 영향을 미칩니다.

그림 4 및 5에 대한 표시그림 2 및 그림 3Flash 크로마토그래프 기둥: FlashPure Select C18(100Å), 30μm 및 EcoFlex C18(100Å), 50μm의 크로마토그래프를 사용하는 동일한 조건(그라디언트 3).입자 크기가 10μm보다 크면 분리 효과가 뚜렷하지 않다.표면 상호작용의 감소는 흡착과 흡착 해제 사이의 균형 단계를 더욱 제한하여 이 경도가 효과적으로 분리될 수 없게 한다.따라서 모든 단백질은 10% 의 경도로 동시에 씻어낸다.또한 입자 크기가 증가함에 따라 더 많은 단백질이 10% 에서 함께 씻겨 이전에 관찰된 30% 의 씻김을 줄였다.

결론

참고문헌