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개요
제자리교잡검사의 기본원리는 핵산분자의 단사슬간의 상호보완적인 염기서렬을 리용하여 방사성 또는 비방사성이 있는 외원핵산 (즉 탐침) 과 조직, 세포 또는 염색체에서 측정할 DNA 또는 RNA를 상호보완배합하여 전일한 핵산교잡분자로 결합시켜 일정한 검사수단을 거쳐 측정할 핵산이 조직, 세포 또는 염색체에서의 위치를 표시하는것이다.
제품 정보
FISH 실험 방법 및 절차
하나.프로브 변성
탐침을 75oC 항온 수욕에서 5min을 온육하고 즉시 0oC, 5~10min을 설치하여 쌍사슬 DNA 탐침을 변성시킨다.
2.표본 변성
① 제조된 5-8um의 유리 조각 표본을 50oC 배양함에서 2~3h 구워낸다. (기엠사로 염색된 표본은 고정액에서 미리 퇴색한 후 구워야 한다.)
② 유리 조각 표본을 추출하여 70~75oC의 체적분수 70% 메틸아미드/2×SSC의 변성액에 2~3min 변성시킨다.
③ 표본을 즉시 순서대로 체적분수 70%, 체적분수 90%, 체적분수 100% 얼음에탄올 계열로 5min씩 탈수한 후 공기가 건조하다.
셋.교잡
변성 또는 예퇴화된 DNA 탐침 10μL를 변성 및 탈수된 볼륨 표본에 떨어뜨리고 18 × 18 덮개 볼륨을 덮고 Parafilm으로 봉하여 습한 어두운 상자에 37oC 교잡 하룻밤 (약 15~17h) 을 보낸다.교잡액이 적고 교잡온도가 높으며 지속시간이 길기 때문에 표본의 습윤상태를 유지하기 위해 이 과정은 습함에서 진행된다.
사.씻다
이 단계는 비특이성 결합 프로브를 제거하여 밑바닥을 낮추는 데 도움이 된다.
(1) 교잡 다음 날, 37oC 온도 상자에서 표본을 제거하고 블레이드로 덮개 볼륨을 살짝 벗깁니다.
(2) 교잡된 유리 조각 표본을 예열된 42~50oC의 체적 분수 50% 메틸아미드/2 × SSC에 배치하여 5min씩 3회 세탁한다.
(3) 예열된 42~50oC의 1×SSC에서 5min씩 3회 세탁한다.
(4) 실온에서 볼트 표본을 2 × SSC에서 가볍게 씻는다.
(5) 유리 조각을 꺼내 자연 건조한다.
(6) 200 μL의 재염색 용액 (PI/antifade 또는 DAPI/antifade 염색액) 을 취하여 유리 표본에 넣고 유리 조각을 덮습니다.
다섯.형광 현미경 관찰 FISH 결과
