CCK-8 키트(세포 증식 및 독성 검사)

CCK-8 키트라고 약칭하는 Cell Counting Kit-8은 MTT법의 대체 방법으로, WST (수용성 테트라졸염, 화학명: 2-(2-메탄산기-4-니트로벤젠)-3-(4-니트로벤젠)-5-(2,4-이황기벤젠)-2H-테트라졸단나트륨염) 을 기반으로 세포 증식과 독성 세포의 빠른 검출에 널리 사용되는 민감도 높은 키트이다.약물선별, 세포증식측정, 세포독성측정, 종양알레르기 등 시험에 사용할수 있다.

사용 설명:
1. 표준곡선을 제작(세포의 구체적인 수량을 측정할 때(세포의 구체적인 수량을 측정할 때)
1. 먼저 세포계수판으로 제조한 세포현액중의 세포수를 계산한후 세포를 접종한다.
2. 비례에 따라 순서대로 배양기 등비로 하나의 세포 농도 사다리로 희석하고, 일반적으로 3~5개의 세포 농도 사다리를 만들고, 각 그룹은 3~6개의 복공을 해야 한다.
3. 접종 후 세포 밀착벽까지 배양한 후 CCK-8 시약을 첨가하여 일정 시간 배양한 후 OD값을 측정하여 세포 수를 가로 좌표(X축), OD값을 세로 좌표(Y축)로 하는 표준 곡선을 만든다.이 표준곡선에 따라 알 수 없는 샘플의 세포 수를 측정할 수 있다 (이 표준곡선을 시험적으로 사용하는 전제는 실험의 조건이 일치해야 하며 세포의 접종 수량과 CCK-8을 넣은 후의 배양 시간을 쉽게 확정할 수 있다.）

2. 세포 활성 검사

1. 96공판에 세포현액(100µL/공)을 접종한다.배양판을 배양함에 넣어 미리 배양한다(37℃, 5% CO2의 조건에서).

2. 구멍당 10µL의 CCK-8 용액을 첨가한다(구멍에 기포가 생성되지 않도록 주의한다. 이들은 OD값의 판독수에 영향을 줄 수 있다).

3. 배양판을 배양상자에서 1-4시간 동안 부화시킨다.

4. 효소 측정기로 450nm에서의 흡광도를 측정한다.

5. OD값을 잠시 측정하지 않고 나중에 측정할 계획이라면 구멍당 10µL 0.1M의 HCl 또는 1% SDS(W/V) 용액을 넣고 배양판 피광을 가려 실온 조건에 보관할 수 있다.24시간 동안 흡광도는 변하지 않습니다.

3. 세포증식-독성검측

1. 96공판에 100µL의 세포현액을 배치한다.배양판을 배양함에서 24시간 사전 배양(37℃, 5% CO2의 조건에서).

2. 배양판에 10µL의 다른 농도의 측정 대기 물질을 첨가한다.배양함에서 적당한 시간 (예: 6, 12, 24 또는 48시간) 동안 부화시킨다.

3. 구멍당 CCK-8 용액 10µL를 첨가합니다(구멍에 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. OD값의 판독에 영향을 줄 수 있습니다).측정 대기 물질이 산화성이나 환원성이 있다면 CCK-8을 추가하기 전에 신선배지(배지를 제거하고 배지로 세포를 두 번 세척한 뒤 새로운 배지를 넣는 것)를 교체해 약물 영향을 제거할 수 있다.

4, 배양판을 배양상자에서 1-4시간 부화시킨다.

5. 효소 측정기로 450nm에서의 흡광도를 측정한다.

6. OD값을 잠시 측정하지 않고 나중에 측정할 계획이라면 구멍당 10µL 0.1M의 HCl 또는 1% SDS(W/V) 용액을 넣고 배양판 피광을 가려 실온 조건에 보관할 수 있다.24시간 동안 흡광도는 변하지 않습니다.

활력계산:.

세포 활력(%) = [A(가약)-A(공백)] / [A(0가약)-A(공백)] ×100

A(가약): 세포, CCK-8 용액과 약물 용액이 있는 구멍의 흡광도

A(공백): 세포가 없는 배양기와 CCK-8 용액을 가진 구멍의 흡광도

A(0가약): 세포, CCK-8 용액이 있고 약물 용액이 없는 구멍의 흡광도

세포 활력: 세포 증식 활력 또는 세포 독성 활력

참고 사항:

① 먼저 몇 개의 구멍을 만들어 접종 세포의 양과 CCK-8 시약을 넣은 후의 배양 시간을 모색하는 것을 권장한다.

② 백혈구는 배양하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있다.

③ 표준 96 공판을 사용할 때 밀착 세포의 최소 접종량은 최소 1000 개/공(100 µL 배양기)입니다.백혈구 검출 시 민감도가 상대적으로 낮기 때문에 권장 접종량은 구멍(100µL 배양기) 2천500개 이상이다.24홀 또는 6홀 실험을 사용하려면 먼저 구멍당 접종량을 계산하고 구멍당 배지 전체 부피의 10%에 CCK-8 용액을 넣는다.

④ 450nm 필터가 없으면 430-490nm 사이의 흡광도를 가진 필터를 사용할 수 있지만 450nm 검출 감도가 가장 높다.

⑤ 배지에서 페놀홍의 흡광도는 계산할 때 빈 구멍의 본바닥 흡광도를 제거하여 제거할 수 있으므로 검사에 영향을 주지 않는다.