서문

항체-소분자약물 우연물(antibody drug conjugates, ADCs)은 치료성 생물제품의 일종으로 항체를 통해 표적세포를 정확하게 식별하고 내삼키기 작용을 통해 표적세포에 진입한 후 우연된 소분자약물을 방출하여 표적세포를 정확하게 사멸하는 목적을 실현할 수 있으며 정상세포에 대한 살상을 최대한 줄일 수 있다.ADC의 설계 원리로 인해 2000 년 최초의 ADC 약물 인 Mylotarg에 비유된"생물 미사일"에 형상적으로 비유되었습니다.® (gemtuzumab ozogamicin) FDA 승인 후 [1] 2025년 6월까지 전 세계에서 19개의 ADC 출시가 승인되었다.2023년 전 세계 ADC 판매 총액이 처음으로 100억 달러를 돌파한 이후 2024년 전 세계 ADC 판매 총액은 계속 100억 달러를 넘어서며 강한 성장세를 이어갔다.

2024년 전 세계 ADC 판매량 상위 10위 ADC 중 2위는 로슈에서 생산한 KADCYLA(엔메덴탈주·허셀레)다.2013년 FDA로부터 HER2 양성 유방암 치료용으로 시판 승인을 받은 이 약은 2024년 전 세계 매출이 약 23억 달러[2]다.엔메타디올단항은 안정된 티오에테르 연결체인 MCC(4-[N-마래아미드메틸] 에폭시-1-카르복실산에스테르)와 마이크로튜브 억제제인 DM1(메탄신 유도체)의 공가 결합을 통해 분자량 분포 범위는 약 147~1-카르복실산에스테르/카르복실산에스테르(DAdriodr/587~1) 항항항으로 DA7 ~ 1 단비 분포되어 있다.구조의 복잡성 때문에 그에 대한 표징은 매우 도전적이다.이 글의 연구에서, 우리는 올해 미국 질량 스펙트럼 연례 회의 (ASMS) 에서 방금 발표 한 것을 사용합니다.차세대 2중 초고해상도 스펙트럼 Excedion Pro BiopharmaKADCYLA에 대한 전면적인 표징은 이 플랫폼이 생물제약 분야에서 뛰어난 분석 능력을 증명하였으며, 특히 전자전이해리 보조 고에너지 충돌파열(electron-transfer/higher-energy collision dissociation, EThcD) 기능은 약물의 짝짓기 지점을 정확하게 감정하고 번역 후 수식(Post-translational dication)의 PTfication 기능을 감정하는데 도움이 된다.

포인트 적용

앞서 언급했듯이 올해 새로 출시 된 차세대 2 합 1 초고해상도 질량 분광기 인 Excedion Pro Biopharma는 KADCYLA의 심층 표현에 사용됩니다.이 기기의 하이라이트는 m/z=1200 Da로 확장된 품질 검사 범위 (BioPharma option 구성 필요) 를 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 비변성 조건에서 단일 클론 항체 단일체/이중 폴리머/3 폴리머, 기타 대분자량 단백질 복합체에 대한 분자량 측정을 충족시킬 수 있다;옵션으로 제공되는 ETD 기능은 빠르고 민감한 ETD/EThcD 파열, 고에너지 충돌 파열(Higher-energy Collisional Dissociation, HCD)과 함께 사용할 수 있으며 포괄적이고 풍부한 단백질 서열 커버리지 및 PTM 감정 정보를 얻을 수 있다.Excedion Pro Biopharma 기기 구조는 그림 1과 같습니다. 그림 2는 이번 실험에서 KADCYLA 심층 표징의 과정을 보여줍니다.

그림 1. Excedion Pro BioPharma 구조도, 이전 세대 제품에 비해 하드웨어 업데이트 부분이 그림에 파란색으로 강조 표시됩니다.BioPharma Edition 옵션은 품질 검사 범위를 m/z=1200Da(녹색 상자 부분)로 확장할 수 있으며, ETD 옵션은 ETD/EThcD 파열(빨간색 상자 부분)을 구현할 수 있다.(큰 그림을 보려면 클릭)

그림 2. KADCYLA 표징 흐름도.

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비변성 조건에서 KADCYLA 전체 분자량 측정

완전분자량측정은 생물의약류 제품표징에서 반드시 없어서는 안될 하나로서 ADC의 경우 완전분자량외에 평균 DAR값과 약물부하분포 (drug load distribution, DLD) 도 약물의 질을 평가하는 관건적인 속성이다.이 실험에서는 KADCYLA에 대한 완전한 분자량 측정을 비변성 조건에서 수행했습니다.비변성조건은 중성완충염체계를 사용하는데 변성조건에 비해 단백질분자가 그 천연상태에 더욱 접근하고 비변성조건에서 단백질대전기가 더욱 적으며 린접전하상태간의 질량스펙트럼봉중첩이 더욱 적어 질량스펙트럼신호간의 상호교란을 줄일수 있어 더욱 정확한 완전분자량측정결과를 얻는데 도움이 된다.그림 3은 KADCYLA 비변성 조건에서 전체 분자량을 측정한 결과를 보여준다.샘플을 천연 상태에 더 가깝게 만들기 위해 우리는 그것을 탈당 처리하지 않았다.그림 3A에서 볼 수 있듯이, 원시 스펙트럼 차원에서 서로 다른 수의 약물과 서로 다른 당형 성분을 짝짓기하는 질량 스펙트럼 봉은 기본적으로 기선 분리를 실현하고, 권적을 해제한 후 0~8의 약물 짝짓기 분포 (그림 3B) 를 선명하게 관찰할 수 있으며, BioPharma Finder 소프트웨어는 자동으로 평균 DAR 값을 계산할 수 있으며, 이 ADC의 평균 DAR 값은 3.47 (그림 3C) 로 문헌 보도의 3.5와 일치한다.

(A)

(B)

(C)

그림 3. 비변성 조건에서 KADCYLA 전체 분자량 측정 결과. A,원본 스펙트럼 및 부분 증폭도.B,볼륨 스펙트럼을 풀다.C, BioPharma Finder 소프트웨어는 관련 그룹을 자동으로 선택하고 평균 DAR 값을 계산합니다.(큰 그림을 보려면 클릭)

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데이터 의존성의 EThcD 2단계 파열은 펩타이드 그래프 분석에 사용됩니다.

PTM 인증 및 짝짓기 위치 지정

액질련용에 기초한 펩타이드도분석은 생물치료형제품표징에서 흔히 사용하는 분석방법의 하나로서 서렬피복도, 각종 화학수식위치확정과 흔히 번역한후 수식하는 정성정량분석 등을 실현할수 있다.각종 질량 스펙트럼 파열 기술에서 HCD 파열은 펩타이드 키를 끊은 후 풍부한 b/y 파편 이온을 생성하여 펩타이드 세그먼트 감정에 사용할 수 있기 때문에 펩타이드 그래프 분석에 널리 응용된다.그러나 일부 코스메틱 펩타이드 세그먼트, 예를 들어 글리코겐, 연결자-약물 콤비네이션 펩타이드 세그먼트 등은 HCD가 사슬/연결자-약물 콤비네이션을 깨뜨릴 수 있기 때문에 여러 개의 잠재적 코스메틱 위치가 있는 펩타이드 세그먼트에 대해 HCD 파열을 사용하여 코스메틱 위치를 정확하게 정할 수 없습니다.또한 글리포세이트/이소아미노산, 텐동아미노산/텐동아미노산 이소화 등 이질화 아미노산을 함유한 일부 펩타이드 세그먼트에 대해서는 HCD에서 발생하는 b/y 이온의 질이 같기 때문에 구분할 수 없다.ETD는 반응 기리가 다르기 때문에 펩타이드 세그먼트의 뼈대를 깨뜨리는 동시에 당사슬, 연결자-약물 우연 등 사이드체인 수식을 완전하게 보존할 수 있을 뿐만 아니라 이질화 아미노산에 대해서도 특징적인 진단 이온을 생성할 수 있어 이질화 아미노산의 감정과 구분을 실현할 수 있다.ETD 파열을 기초로 HCD 보조 파열, 즉 EThcD를 첨가하면 같은 2급 스펙트럼에서 b/y 및 c/z 이온을 동시에 얻을 수 있으며, 더욱 전면적이고 풍부한 정보를 얻어 펩타이드 세그먼트, 특히 수식/이구화 펩타이드 세그먼트의 표징을 실현할 수 있다.Excedion Pro 2-in-1 초고해상도 스펙트럼에는 ETD 옵션이 장착되어 빠르고 민감한 ETD/ETchD 파열이 가능하며, 데이터 의존성을 설정할 수 있는 EThcD 2단 파열(data dependent EThcD MS2, dd EThcD MS2) 데이터 수집 모드, 데이터 의존성 EThcD 2단 파열(dHCD MS2)과 포괄적인 펩타이드 분석을 통해 펩타이드 정보를 상호 보완할 수 있다.

본고의 연구에서 우리는 각각 Trypsin과 AspN 두 가지 단백질 효소를 사용하여 KADCYLA에 변성 효소 분해를 진행하였고, 그 후 두 가지 서로 다른 단백질 효소 분해 샘플에 대해 모두 dd HCD MS2 및 dd EThcD MS2 데이터 수집을 진행하여 서열 커버리지, 우연적 위치 분할 및 번역 후 수식 등의 정보를 얻었다.dd HCD MS2, Trypsin 및 AspN 효소 분해를 사용한 샘플은 모두 한 바늘 샘플의 100% 시퀀스 커버리지를 실현할 수 있습니다 (데이터는 표시되지 않음).그림 4는 dd EThcD MS2, Trypsin 및 AspN 효소 분해를 사용한 샘플 펩타이드 그래프 분석의 베이스 피크 크로마토그램 (Base Peak Chromatogram, BPC) 및 시퀀스 커버리지를 보여줍니다. 마찬가지로 1침의 100% 시퀀스 커버리지에 도달할 수 있습니다. Excedion Pro 2합일 초고해상도 질량 스펙트럼의 ETD/ETchD 파열은 일반적인 펩타이드 크로마토그래프와 호환될 수 있습니다.

그림 4. KADCYLA 펩타이드 맵은 베이스 피크 스펙트럼 및 시퀀스 커버리지를 분석하며 모두 dd ETchD MS2 데이터 수집 모드입니다.왼쪽, Trypsin 효소 분해 샘플.오른쪽, AspN 효소 분해 샘플.서로 다른 단백질 효소 분해 샘플에 대해 모두 단침 샘플 100% 시퀀스 커버를 실현할 수 있다.(큰 그림을 보려면 클릭)

앞에서 설명한 바와 같이 KADCYLA의 연결자-약물 (MCC-DM1) 은 공가 결합 방식을 통해 라이신에 우연되어 있으며, 타르비드 단항의 N 끝에도 우연이 발생하기 때문에 전체 KADCYLA 분자의 경우 잠재적인 우연 위치는 모두 92개이며, 그 중 중복되지 않는 위치는 46개 (그림 5) 이다.라이신이 공가 우연되면 공간 비트 저항이 생겨 trypsin이 새기 때문에 trypsin 효소 분해는 여러 개의 라이신을 포함하는 연결 서브-약물 우연 펩타이드 세그먼트를 생성하고 HCD 파열은 펩타이드 세그먼트의 뼈대와 우연 약물을 동시에 깨뜨려 HCD 2급 스펙트럼만으로 약물 우연 비트를 정확하게 판단할 수 없다.EThcD는 파열의 메커니즘이 다르기 때문에 펩타이드 세그먼트의 뼈대를 파열하는 동시에 약물 우연 기단을 보존할 수 있으며, 최적화된 HCD의 보조 파열 에너지는 펩타이드 세그먼트의 파열을 더욱 충분하게 할 수 있으며, 동시에 완전한 우연의 약물을 최대한 보존할 수 있다.표 1은 HCD와 EThcD를 각각 사용하여 Trypsin 효소 분해 샘플을 2단계 파열하여 얻은 약물 우연점 정보를 취합한 것을 보여주며, 46개의 잠재적 수식 위치 중 43개의 약물 수식이 존재하는 것을 감정한 것을 볼 수 있다. EThcD 파열을 사용하여 여러 개의 잠재적 우연점을 함유한 펩타이드 구간에 대해 우연위치를 정확하게 정할 수 있고, HCD 결과와 결합하여 전면적인 우연점 정보를 얻을 수 있다.

그림 5. KADCYLA 분자의 모든 잠재적 수식 비트는 빨간색 상자로 단백질 서열에 표시되어 있으며, 총 92개의 비트이며, 그 중 중복되지 않는 비트는 46개이다.

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표 1. KADCYLA 공인 위치 요약

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빨간색 글꼴, 짝짓기 비트."++", 짝짓기 비트는 2단 조각 이온을 통해 확인할 수 있습니다."+", 이 펩타이드 세그먼트에는 우연이 존재하지만 파편 이온을 통해 구체적인 우연 위치를 확인할 수 없습니다."-", 우연으로 확인되지 않았습니다.

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AspN을 사용하여 KADCYLA를 효소 분해하면 체인이 세 개의 라이신을 포함하는 펩타이드 세그먼트 D를 생성합니다.K(216)K(217)VEP는K(221)SC，또한 trypsin 효소 분해 샘플의 펩타이드 그래프 분석 결과를 통해 알 수 있듯이, 이 세 개의 라이신은 모두 우연될 가능성이 있다.KADCYLA의 MCC-DM1 연결자-약물은 이기종 중심 (그림 6, 왼쪽 위) 을 함유하고 있어 약물 우연성 펩타이드 세그먼트가 반상 크로마토그래프에서 모두 대봉 형태로 씻겨진다.그림 6에서 볼 수 있듯이 여러 개의 잠재적인 짝짓기 비트와 MCC-DM1 이성화 중심의 존재로 인해 펩타이드 세그먼트 DK(216)K(217)VEP는K(221)SC의 추출 이온 흐름 그래프(Extract ion current, XIC)는 여러 세트의 피크를 나타냅니다.EThcD 파열로 인한 정보가 풍부한 2단계 스펙트럼 덕분에 보존 시간에 따라 씻겨진 펩타이드 세그먼트가 어느 위치에서 우연이 발생했는지 정확하게 감정할 수 있다 (그림 6, 아래), XIC 피크 면적에 따라 각 수식의 상대 비율을 계산할 수 있다 (그림 6, 오른쪽 위).

그림 6. EThcD를 통해 여러 개의 짝짓기 비트가 포함된 펩타이드 세그먼트를 짝짓기 비트로 감정한다.(큰 그림을 보려면 클릭)

ADC 샘플의 경우 약물 우연성 위치 외에도 약품 품질과 관련된 각종 번역 후 수식도 표징과 모니터링이 필요하다.그림 7은 EThcD 기반 2단계 파열 스펙트럼 그래프, 펩타이드 세그먼트 FNWYVisoD(283)GVEVHNAK의 텐동아미노산 이질화 감정 결과.기기 플랫폼의 높은 감도와 고품질 정밀도 덕분에 상대 함량이 미수식 펩타이드 세그먼트 0.18% 의 이구화 펩타이드 세그먼트만 있더라도 풍부한 c/z 이온, 그리고 텐동아미노산 이구화가 ETD 파열에서 발생하는 특징성 c+57/z-57 이온을 감정할 수 있어 텐동아미노산 이구화의 확증을 실현할 수 있다.탈아미드, 산화, 당기화 등 기타 흔히 볼 수 있는 번역 후 수식에 대해 상대적인 정량 결과를 얻을 수 있다 (그림 8).

그림 7. EThcD 파열을 사용하여 텐동아미노산의 이질화를 확인한다.아래 부분 확대도에서 c+57/z-57 이온을 관찰할 수 있습니다.(큰 그림을 보려면 클릭)

그림 8. 기타 일반적인 번역 후 상대 정량 결과를 수정, 모든 결과는 3핀 dd ETchD MS2 반복 샘플링 평균입니다.A,메티오닌 산화.B,아세트아미드 탈아미드.C,아세트아미드 후포아미드화.D,트립토판 산화.E,중연 N-당기화.(큰 그림을 보려면 클릭)

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요약

이 글은 라이신이 짝으로 연결된 ADC KADCYLA를 차세대 2중 초고해상도 질량분석기 Excedion Pro BioPharma를 사용하여 표징한 실험 결과를 보여준다.비변성 조건에서 KADCYLA에 대한 완전한 분자량 측정은 탈당 조건 없이 약물 우연성 수 0~8의 분포를 측정할 수 있으며, 소프트웨어 처리 후 얻은 평균 DAR 값은 3.47로 보도된 3.5와 일치한다.빠르고 민감한 EThcD 파열은 단침 샘플링 100% 서열 커버, 흔한 번역 후 수식 감정과 상대 정량을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 우연점 감정, 이구화 아미노산 감정 등을 실현하여 복잡한 생물 분자의 전면적인 표징에 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있다.

참조 문서:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. 항체 약물 연합: 대상 암 치료를 위한 "생물학적 미사일".Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. 항체-약물 연합물: 지난 십년.제약품 2020, 13, 245.

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