병원성 세균 감염은 공중보건에 심각한 위협이 된다. 특히 만성과 급성 상처에서 세균의 정식과 생물막의 형성으로 상처가 아물기 더욱 어려워진다.활성산소 (ROS) 기반 치료법은 광범위한 항균 활성 및 낮은 내성의 이점을 가지고 있으며 현재 감염 외상을 치료하는 비항생제 전략이되었습니다.그러나 그 림상응용은 여전히 약품공급효률이 낮고 세균의 표적성이 낮으며 치료후 염증이 통제력을 잃는 등 문제에 국한되여있다.

이를 위해 우한대학 약학원 리웨이 교수팀은 효과적인 멸균과 상처 치유를 촉진하기 위한 다기능 이중 마이크로핀 패치 (LFT/S-MN) 를 설계했다.이 패치는 양전하를 띤 락틴기 나노입자(LFT NPs)와 포르민 음향민감제(TAPPFe)를 결합해 용해 가능한 기저층에 배치하는 한편 pH가 응답하는 바늘끝층에 항염증제인 스피리딘(SPD)을 탑재한다.미세침이 감염조직에 삽입되면 방출된 LFT NPs는 효과적으로 음전하세균을 표적하고 집결시켜 초음파자극하에 협동하는 화학동력화음동력료법 (CDT/SDT) 을 통해 대량의 ROS를 생성할수 있다.이와 동시에 상처의 산성미환경은 침첨층의 점진적인 분해를 촉발하여 SPD의 통제방출을 실현하고 면역조절을 진행하였다.동록색 가짜 단포균(P. aeruginosa)에 감염된 생쥐의 상처 모델에서 LFT/S-MN 패치는 세균 부하를 현저하게 줄이고 염증 반응을 억제하며 콜라겐 퇴적과 신생 혈관 형성을 촉진하고 상처 폐합을 가속화했다.

이 작업은 협력 CDT/SDT와 염증 조절을 통해 상처 항균 및 조직 재생을 달성하는 유망한 비항생제 전략을 제시합니다.이 마이크로핀 패치는 모방 정밀면 투영 마이크로 입체 광각(P μSL) 기술(microArch)을 이용한 것이다® S240，정밀도: 10μm) 3D 프린팅으로 금형을 가공한 후 PDMS 리폼을 통해 제작되었으며, 관련 연구 성과는'Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing'이라는 제목으로 저널'Journal of Controlled Release'에 실렸다.무한대학 약학원 2023급 박사연구생 강붕을 론문저자로 하고 려위교수를 론문통신저자로 하며 무한대학 약학원을 론문완성단위로 하며 이상의 연구사업은 국가자연과학기금프로젝트와 무한대학 태강생명의학센터 PI경비의 지지를 받았다.

그림 1에서 볼 수 있듯이, 이 패치는 용해 가능한 기층에 포르피린 음향민감제 (TAPPFe) 와 짝을 이루는 양전하를 띤 락틴 나노입자 (LFT NP) 와 항염증제 아정아민 (SPD) 을 부하하는 pH 응답 첨층을 통합했다.감염 조직을 삽입하면 방출되는 LFT NP는 음전하를 띤 박테리아를 효과적으로 표적하고 집결시켜 초음파 자극에 의한 협동화학 동력학 화음 동력학 요법(CDT/SDT)을 통해 강력한 ROS를 생성한다.이와 동시에 산성상처의 미세환경은 첨층의 점진적인 분해를 촉발하여 통제할수 있는 SPD를 방출하여 면역조절을 진행한다.동록색 가짜 단포균에 감염된 생쥐의 상처 모델에서 LFT/S-MN 패치는 세균 적재량을 현저히 낮춰 염증을 억제하고 콜라겐 퇴적과 신생 혈관 형성을 촉진하며 상처 폐합을 가속화했다.

그림 1. LFT/S-MN 패치가 감염된 상처를 치료하는 구조와 치료 메커니즘 설명도.(A) 이중 LFT/S-MN 패치의 설계 및 제조는 양전하 LFT NPs를 부하하는 가용성 베이스와 SPD를 패키지하는 pH 응답 팁으로 구성되어 있다.(B) 감염된 상처에 삽입되면 기저층이 신속하게 용해되어 LFT NPs를 방출하고, LFT NPs는 음전하를 가진 세균을 적극적으로 표적하며, SDT와 CDT와 협동하여 US 아래에서 ROS를 생성하여 효과적인 세균 제거를 실현한다.이와 동시에 산성상처의 미세환경은 첨층분해를 촉발하여 SPD가 지속적으로 방출되여 염증조절에 사용되였다.이 공동 전략은 박테리아 제거, 면역 조절 및 조직 재생을 촉진하고 궁극적으로 상처의 치유를 가속화합니다.

비트 특이성을 실현하고 약물 방출을 제어하기 위해 순차 성형 정책을 사용하여 pH 응답 이중 MN 패치를 제조하였는데, 이를 LFT/S-MN 패치라고 한다.시각화 및 구조 검증을 위해 두 개의 형광 프로브, 로댕민 B가 표시한 우혈청백단백질(RhB-BSA)과 이소티오시안산형광소(FITC)는 각각 나노입자의 첨과 기저층에 적재된다(그림 2A와 B).첨층은 자외선 유도 자유기중합과 메틸아크릴산껍질폴리당(CSMA)과 SPDTA 사이의 시부린을 교합해 합성한 것으로, 기저층은 18wt%의 폴리에틸렌글리콜(PVA)과 사탕수수당 용액으로, 후면층은 20wt%의 폴리스티렌(PS)으로 구성됐다.에너지 색산 X선 분광 (EDS) 분석 (그림 2C) 에 따르면 LFT NPs에서 온 철 원소는 기저층에 국한된 균일한 분포를 보이고 있으며 첨층의 탄소 원소는 균일한 분포를 보여 뚜렷한 공간 분리를 나타낸다.얻은 LFT/S-MN 패치는 약 0.5 cm2 (그림 2D) 의 10 × 10 MN 어레이로 구성되어 있습니다.각 바늘은 약 850 μm 높이의 명확한 원추형 형태를 가지고 있으며 뚜렷한 이중 구조를 가지고 있습니다 (그림 2E 및 F).역학 테스트에 따르면 각 바늘의 단열력은 약 4N (그림 2G) 으로 효과적인 경피 삽입과 잠재적인 임상 응용을 실현하기에 충분하다.

그림 2. LFT/S-MN 패치의 표징.(A-B) LFT/S-MN 패치의 대표적인 명장과 형광 이미지는 성분이 섞인 구조의 완전성과 형광 표시를 설명한다.(C) 스펙트럼은 MNs 내 요소의 분포를 확인합니다.(D) 광학 이미지 및 (E, F) SEM 이미지는 LFT/S-MNs의 모양을 보여줍니다.노란색 파선은 ph가 팁 및 용해 가능한 베이스 사이의 인터페이스에 응답함을 나타냅니다.(G) LFT/S-MNs의 힘-변위 곡선은 피부 관통에 적합한 기계적 강도를 나타냅니다.

이체 돼지 가죽으로 LFT/S-MN 패치의 피부 투과 능력을 평가한다.응용후 MNs는 각질층을 성공적으로 돌파하고 봉인된 형광염료를 피부에 수송하여 형광영상표시 (그림 3A), 조직학횡단면실증 (그림 3B) 을 하였다.형광 현미경을 통해 LFT NPs의 용출 행위와 그 후의 방출을 관찰한다.그림 3C에서 볼 수 있듯이, 베이스 레벨은 80초 이내에 PBS (pH 7.4)에 용해되어 LFT NPs가 MN 베이스에서 빠르게 방출되도록 촉진합니다.저자는 감염된 상처의 미세 환경이 일반적으로 산성이라는 점을 고려하여 MN 팁의 pH 응답 행동을 더 연구했습니다.체외방출연구에 따르면 첨층은 경도산성조건(pH 5.6)에서 점차 분해되여 15일째가 되면 거의 분해되는데 중성조건(pH 7.4)에서 최소분해(그림 3D)가 발생하여 첨층의 산민감행위를 표명한다.약물 적재 및 배달 효율을 정량적으로 측정합니다 (그림 3E 및 F).LFT는 145.43±2.76μg, SPD는 14.96±0.08μg이다.피부 투여 후 LFT 경MNs 투여량은 132.83±2.91μg, SPD 경MNs 투여량은 14.38±0.22μg으로 두 약물 모두 투여 효율이 90%를 넘었다.또한 SPD의 산성 조건(pH 5.6)에서의 누적 방출량은 15일째 88.87±3.58%로 PBS(pH 7.4)보다 월등히 높아 MN첨의 산응답 방출 스펙트럼(그림 3G)을 더욱 확인했다.

그림 3. LFT/S-MN 패치의 약물 방출 평가.(A) LFT/S-MN 패치 이식 후 돼지 이체 피부의 대표적인 밝기 및 형광 현미경 이미지.(B) MN 패치가 이식된 돼지 피부 조직학 절편.(C) 광학 이미지는 80초 동안 PBS에서 기저층의 빠른 용해와 뾰족층의 분리를 보여준다.(D) 거꾸로 형광 현미경 이미지는 다른 pH 조건(pH 7.4 및 5.6)에 표시되며 중성 및 경도 산성 상처 환경을 시뮬레이션하면 MN은 15 일 이내에 분해됩니다.(E) LFT/S-MN 패치 LFT 마운트 및 배달의 계량화.(F) LFT/S-MN 패치 SPD 마운트 및 배달의 계량화.(G) LFT/S-MNs에서 SPD는 시간의 체외 누적에 따라 곡선을 방출한다.데이터는 mean ± SD(n = 3개의 개별 샘플)로 표시됩니다.

저자는 LFT/S-MN 패치의 체외 항균 효과를 체계적으로 평가했다.그림 4D와 같이 초음파 조사(3MHz, 0.97 W/cm2, 50% 점유 공비, 30 min)에서 LFT의 최소 억제 농도(MIC)는 128μg/mL이다.별도의 LFT/S-MN 패치는 황색포도상구균에 36.41±0.75%, 동록색 가짜 단포균에 35.87±1.48%(그림 4A와 E)의 중간 정도의 항균 활성을 보였다.이에 비해 초음파가 활성화되면 LFT/S-MN 패치의 세균 억제율이 99.95 ± 0.04%, 99.96 ± 0.04% (그림 4E) 로 크게 높아져 세균이 거의 활성화되지 않았음을 보여준다.SYTO 9/PI 염색은 이러한 결과를 더욱 검증했으며 LFT/S-MN US 그룹은 광범위한 박테리아 사망을 나타내는 주요 적색 형광을 나타냅니다 (그림 4B 및 F).스캐닝 렌즈 (SEM) 는 추가 형태학적 증거를 제공합니다.처리되지 않은 그룹의 박테리아는 완전하고 매끄러운 막을 유지했으며 초음파 활성 LFT/S-MN에 노출 된 박테리아는 명백한 구조 파괴와 막 파열을 나타냅니다 (그림 4C).전반적으로 이러한 발견은 초음파가 활성화되면 LFT/S-MN 패치가 대량의 국소 ROS를 생성하여 병변 부위에서 박테리아를 효과적으로 박멸할 수 있다는 것을 확인합니다.

그림 4. LFT/S-MN 패치 체외 항균 성능 연구.(A) 황색포도상구균과 동록색 가짜 단포균에 대한 LFT/S-MNs의 항균 효과를 보여주는 조지판의 대표적인 사진.(B) 형광현미경 이미지는 황색포도상구균과 동록색 가짜 단포균이 서로 다른 처리 조건에서 ROS로 인한 산화 스트레스 발생을 나타낸다.(C) 처리된 세균 형태의 SEM 이미지는 황색포도상구균과 동록색 가짜 단포균의 막 파괴와 구조 변형을 보여준다.(D) LFT는 LFT/S-MNs에서 황색포도상구균에 대한 최소억제농도(MIC)로 투여의존적인 항균활성을 보였다.빨간색 화살표는 LFT의 MIC 값을 나타냅니다.(E) 처리 후 세균의 활력에 대한 정량적 분석, 활/사 염색 평가를 통해.(F) 생/사 실험에 상응하는 녹색 형광 강도(FI) 측정 결과, 항균 작용이 더욱 입증되었다.데이터는 mean ± SD(n = 3개의 개별 샘플)로 표시됩니다.** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns는 현저성이 없음을 나타냅니다.

저자는 LFT/S-MN 패치의 체내 치료 효과를 검증하기 위해 동록색 가짜 단포균(P. aeruginosa는) 생쥐 피부 트라우마 감염 모델을 만듭니다 (그림 5A).감염된 생쥐를 무작위로 비초음파(Blank, S-MN, LF/S-MN, LFT/S-MN) 및 초음파처리(Blank+US, S-MN+US, LF/S-MN+US, LFT/S-MN+US) 등 8개 그룹으로 나눈다.초음파 시나리오는 3 MHz 일일 조사, 0.97 W/cm2, 50% 공백 비율, 30 분, 3 일 연속입니다.치료 후 0, 1, 3, 5 및 9 일째 사진을 통해 상처의 진행을 모니터링합니다 (그림 5B).1일째, LFT/S-MN+US 그룹은 CDT와 SDT의 공동 항균 작용을 반영하여 농성 침출이 현저히 감소했습니다.이에 비해 비초음파 그룹은 농독과 염증을 더 광범위하게 나타낸다.3일째, 초음파 투여가 완료되면 상처 침대 샘플을 수집하여 세균 배양을 진행하고 잔여 세균 부하를 평가한다 (그림 5E).평판 계수에 따르면 LFT/S-MN + US 그룹의 균락 형성이 가장 적어 체내 항균 활성이 더 강하다는 것을 나타낸다 (그림 5F).9일째가 되면 LFT/S-MN + US가 처리한 생쥐의 상처는 치유율이 높고 조직 재생이 뚜렷하다(그림 5C).전체 치료 과정에서 체중 모니터링에 따르면 각 그룹 사이에 뚜렷한 파동이 없음 (그림 5D), MN 패치가 좋은 전신 생체 적합성을 가지고 있음을 나타냅니다.요약하면, 이러한 결과는 LFT/S-MN이 초음파와 결합하여 박테리아 감염을 효과적으로 제거하고 체내 상처의 치유를 크게 가속화 할 수 있음을 보여줍니다.

그림 5. LFT/S-MN 패치의 체내 항균 효과와 상처 치유 성능.(A) 동록색 가짜 단포균 감염 생쥐 상처 모델의 도식도와 MN 패치를 사용하여 US 자극을 더하거나 넣지 않는 치료 전략.(B) 처치 후 0, 1, 3, 5, 9일째 상처 부위의 대표적인 사진.검은색 가상 코일은 초기 상처 경계를 나타냅니다.(C) 치료 그룹별 상처 치유 시간에 따른 정량 분석 (n = 5).(D) 치료 기간 쥐의 체중 측정 (n = 5).(E) 각 그룹 3일째 상처 침대에서 세균 균락을 배양하는 진지판 사진.(F) 균락형성단위(CFU) 분석을 바탕으로 한 세균 활력 계량화(n = 3).데이터는 mean ± SD로 표시됩니다.*** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns는 현저성이 없음을 나타냅니다.

결론:이 연구는 초음파 활성화의 협동 항균 요법(CDT/SDT)과 산성 미세 환경에서 촉발되는 면역 조절을 통합해 감염 상처에 대한 효율적인 치료를 가능하게 하는 pH 응답의 이중 마이크로핀 패치(LFT/S-MN) 개발에 성공했다.이 패치는 표적 세균의 LFT NPs를 빠르게 방출할 수 있을 뿐만 아니라 초음파에서 세균과 생물막을 제거하기 위해 대량의 ROS를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 상처의 산성 조건에서 SPD를 지속적으로 방출하여 대식세포의 극화를 조절하고 과도한 염증을 억제할 수 있다.체내 실험은 이 전략이 상처의 폐합을 현저하게 가속화하고 조직의 재생을 촉진할 수 있으며 우수한 생물 안전성을 가지고 있다는 것을 증명했다.이 작업은 비항생제에 의존하는 감염 상처 치료와 조직 재생에 임상 전환 잠재력을 갖춘 새로운 전략을 제공합니다.