광유전학 기술은 뉴런 활동에 대한 고정밀 조절 능력으로 현대 신경과학 연구의 중요한 도구가 되었다.전통적인 광유전학실험은 두차례의 독립수술을 진행해야 한다. 즉 광민감단백질유전자를 가진 비루스담체를 주사하고 1~2주 후에 유전자가 표현된후 다시 두번째 수술을 진행하여 광자극탐침을 이식해야 한다.이런 이중수술 방안은 실험의 복잡도를 높일 뿐만 아니라 조직 손상과 염증 반응도 가중시킬 수 있다.
최근 뉴욕 대학 아부다비 분교의 연구팀은3D 프린팅용 다중모드 광유전 신경탐지기(MIO)，광 유전학적 자극과 미세 흐름 제어 약물/바이러스 배달 기능을 단일 장치에 통합이 연구는 전통적인 광유전학 연구에서 여러 차례 수술해야 하는 난제를 해결하는 데 성공해 신경과학 분야에 효율적이고 맞춤형으로 제작할 수 있으며 미세한 상처를 낼 수 있는 솔루션을 제공했다.제목으로"opsin / 약물 배달을 위한 microfluidic 튜브와 통합된 3D 인쇄 optogenetic 신경 프로브”발표국제 저널에과학적 보고서 Scientific Reports》위.MIO는프로브핵심 부품에는 빛 자극을 위한 마이크로 LED(μLED)와 직경 150마이크로미터의 마이크로 흐름 제어관이 포함된다, 실현 가능바이러스 운반체나 약물의 정확한 배달.이 설계 돌파는 전통적인 바이러스 주사와 탐침 이식 이중 수술 절차를 단일 조작으로 최적화하여 실험 절차를 현저하게 간소화했다.연구진은 생쥐의 구뇌저핵 (STN) 인 운동 조절의 핵심 뇌 영역인 탐침 이식을 성공적으로 실시해 단일 수술을 통해 바이러스 운반체 주사와 장비 고정을 동시에 완료했다 (그림 1).그림 1. (a) 전통적인 절차는 입체적인 방향성 주사 바이러스 캐리어를 포함하여 목표 뉴런에서 광민감 시단백질을 표현하고, 그 후 수술을 통해 광학 프로브를 이식하여 통제된 광펄스를 전달하여 뉴런 변조를 진행한다.(b) 마이크로스트림 컨트롤러와 결합하여 바이러스를 전달하는 광유전학 설비 이식의 통합 프로세스.여기에는 장치의 입체적인 방향을 목표 뇌 구역에 배치하는 것이 포함되며, 그 중 미세 흐름 제어관은 특정 뉴런에서 광민감 시단백질을 표현하기 위해 바이러스 운반체를 전달하고, 그 후 동시에 또는 후속으로 광학 프로브를 활성화하여 제어 광펄스를 전달하여 정확한 뉴런 변조를 진행한다.성능 표징에 있어서 연구팀은 MIO에 대해프로브시스템 테스트가 수행되었습니다 (그림 2).전기학 및 광학 테스트 데이터에 따르면 (그림 3), 이 설비는 3.0V 작업 전압 (대응 전류 약 12mA) 에서 블루레이 자극을 안정적으로 출력할 수 있으며, 그 발광 피크 파장 (465nm) 은 ChR2 포토메트릭 단백질의 응답 스펙트럼과 고도로 일치하며, 광의 강도는 활성화 임계값 (1mW/mm²) 을 초과한다.그림 2. (a) 통합 마이크로흐름 제어 채널의 제시된 광전극 설비의 전체 시스템 보기는 시단백질/약물 배달에 사용된다.(b)제예비 MIO 기기의 이미지입니다.이 장치는 1mA 전류에 의해 Blu-ray를 방출합니다.메인 그림은 조명의 광전극을 나타냅니다.오른쪽 그림에는 너비 (약 270 µm) 와 두께 (약 150 µm) 가 각각 표시됩니다.그림 3. (a)μLED의 전기흐름-전압커브(n=5).(b) 부품이 서로 다른 입력 전류에서 측정한 빛의 강도 (n=5).(c)본작업에 사용되는 μLED의 실측상대 광원 강도 (파란 곡선) 와 ChR2 응답 스펙트럼 (검은 곡선) 을 비교합니다.열검증실험은 체내환경을 모의하는 실험조건에서 비교적 높은 자극주파수와 펄스폭을 채용하더라도 탐침의 온도상승은 2°C의 안전한도값내에서 엄격히 통제할수 있다는것을 보여주었다.이 결과는 이 탐침이 우수한 열관리능력을 갖고있어 주위신경조직에 대한 열손상을 효과적으로 피면할수 있으며 장기적인 체신경조절통제의 물리성능에 대한 안정성요구를 만족시킬수 있다는것을 실증하였다.
그림 4. (a) 열 검증 테스트 장치.(b) 입력 전류가 5mAh일 때 자극 속도와 펄스 폭에 따라 측정되는 온도 변화(T).점선 T=2 ℃ 는 안전 임계값을 나타내며, 이 임계값을 초과하면 신경 조직에 열 손상을 초래할 수 있다.
연구는 7주간의 행동학 실험을 통해 MIO 프로브를 이식한 실험군과 기존 광섬유 프로브 (2회 수술 필요) 를 적용한 대조군을 체계적으로 비교했다(그림 5).수치가 보여준데 따르면 광유전자극은 모두 두조의 생쥐의 운동거리와 속도를 뚜렷이 제고시킬수 있다.) 이는 두가지 설비가 모두 STN 뉴런을 효과적으로 활성화하고 운동행위를 조절할수 있다는것을 증명한다.특히 MIO 프로브 그룹은 전체 실험 주기 동안 더 안정적이고 일관된 행동학적 응답을 보여 단일 수술의 통합 이식 전략이 장비에 더 우수한 장기 안정성과 조정 효과를 부여할 수 있음을 제시한다.
그림 5. 광섬유 전극과 쥐의 운동 활동 모니터링에서 MIO 프로브의 응용 비교.mCherry 형광 마커의 면역 조직 화학 분석을 통해 MIO 프로브의 생체 적합성과 기능 유효성을 더욱 검증했습니다.연구자들은 STN 영역에서 명백한 mCherry 발현을 관찰했으며, MIO 프로브가 바이러스 운반체의 표적 배달을 성공적으로 달성하고 목표 뉴런에서 ChR2 단백질의 효율적인 발현을 유도했음을 보여줍니다.이 결과는 분자 차원에서 단일 수술 통합 방안의 타당성을 확인했으며 장기 신경 조절에서 장비의 응용에 핵심 증거를 제공했다 (그림 6).그림 6. STN 영역은 궤적 근처의 mCherry 표현의 대표적인 수평 슬라이스를 이식합니다.
대조군에 비해 MIO 탐침 이식 영역 주변의 뉴런 밀도가 현저히 높다.NeuN 염색 정량 분석을 통해 이식점에서 50-200 μm 떨어진 각 영역에서 MIO 그룹은 더 나은 뉴런 보존 효과를 나타냅니다 (그림 7).성형교세포 마커인 GFAP의 면역조화 분석에 따르면 MIO 그룹의 이식점 주변의 성형교세포 활성화 수준이 현저히 낮아졌다(그림 8).이와 함께 ED1 표기의 활성화된 소교세포 수도 눈에 띄게 줄어 염증 반응의 효과적인 통제가 확인됐다 (그림 9).
이 일련의 조직학적 증거는 단일 수술 전략의 독특한 장점을 강력하게 입증합니다. 반복되는 조직 외상을 피함으로써 이식물로 인한 기계적 손상과 계발성 염증 반응을 크게 줄일 수 있습니다.이러한 보호 작용은 뉴런 수의 보존뿐만 아니라 교질 흉터 형성의 감소에도 반영되어 설비의 장기적인 기능 안정성에 튼튼한 조직학적 기초를 제공한다.그림 7. STN 영역은 궤적 근처의 NeuN 염색의 대표적인 수평 뇌 절편을 이식합니다.그림 8. STN 영역은 궤적 부근의 GFAP 염색의 대표적인 수평 뇌 절편을 이식한다.그림 9. STN 영역은 궤적 부근의 ED1 염색의 대표적인 수평 뇌 절편을 이식한다.제조가 완료된 광전극과 커넥터를 전기적으로 연결하기 위해서는 맞춤형 케이스 내부에 미리 설정된 전기 커넥터 핀에 도선을 안정적으로 고정해야 한다 (그림 10).이 과정에서관련된 모든 맞춤형 케이스 부품은 모방의 정밀한 면 투영 마이크로 입체 광각(P μ SL) 기술을 사용한다(마이크로아치)®S240은精度：10μm)제조 수행。그림 10.설비의 제조 및 조립 프로세스는 세 단계로 나뉜다: (i) 3D 프린팅 프로세스 (a-d), (ii) 전도성 부품 및 마이크로 흐름 제어 부품의 제조 및 조립 (e-k), (iii) 패키지 및 총 조립 프로세스 (l-s).요약: 이 연구는 광 자극과 액체 배달 기능을 통합하여 단일 수술로 바이러스 주사 및 장비 이식을 완료하고 수술 외상 및 면역 반응을 현저하게 낮추며 실험의 효율성과 신뢰성을 향상시키는 3D 프린팅 기술을 기반으로 한 다기능 광 유전학 프로브를 성공적으로 개발했습니다.이 기술의 출현은 기초 신경 과학 연구에 더 강력하고 편리한 도구를 제공 할 뿐만 아니라 미래에 임상 치료를위한 신경 조정 장치 개발 등에 새로운 길을 열었습니다.종재재료과학과 마이크로나노제조기술의 진일보 발전으로 이런 류형의 집적화, 맞춤형신경인터페이스설비는 미래의 신경질병치료와 인간과 컴퓨터의 상호작용 등 분야에서 갈수록 중요한 역할을 발휘하게 될것이다.
