하나,전자동 PCR 기기작업 전 준비

시약 및 소모품 준비

시약: DNA 템플릿, 특이성 유인물 (양방향 및 역방향), dNTPs (4 가지 디옥시 리보핵산), 내고온 DNA 중합 효소 (예: Taq 효소), 완충액 및 Mg² ⁺ 이온 용액을 포함한다.모든 시약은 완전히 녹인 후 혼합하여 농도 오차를 피해야 한다.

소모품: 일회용 무균 PCR 튜브 또는 96 공판을 사용하여 밀봉성이 양호하고 교차 오염을 방지합니다.

구역별 조작: 시약 준비 구역 (초정화 작업대 또는 생물 안전 캐비닛) 에서 시스템 조제를 완료하고, 조작 시 장갑을 착용하고 말을 피하며, 에어로졸 오염을 줄인다.

계기 검사

PCR 기기가 수평 견고한 플랫폼에 배치되어 있고 전원 전압이 일치하며 접지가 양호한지 확인합니다.

시료 슬롯의 청결 여부를 검사하여 잔류물이 온도 전도에 영향을 주지 않도록 한다.

정기적으로 비눗물로 시료홈을 세척하고 강알칼리, 고농도 알코올 또는 유기용제의 사용을 금지한다.

2. 반응체계배합

혼합 시약

비율에 따라 DNA 템플릿, 유인물, dNTPs, DNA 중합효소, 완충액 및 Mg²⁺ 용액을 무균 원심관에 넣고 적당량의 쌍증수를 넣어 최종 부피(15-50μL 권장)까지 정용한다.

주요 매개 변수:

DNA 템플릿 품질: 분해 또는 억제제 오염을 피하십시오. 그렇지 않으면 효율 증대에 영향을 미칩니다.

유인물 설계: 특이성을 확보하고 이중합체 또는 자가상호보완구조를 피하며 퇴화온도는 유인물 Tm값과 일치해야 한다.

mg²⁺ 농도: 너무 높거나 너무 낮으면 효소 활성을 억제할 수 있으므로 시약 설명서에 따라 조정해야 한다.

분장 체계

혼합액을 PCR 튜브에 빠르게 나누어 담고, 튜브 뚜껑을 꼭 덮거나 전용막을 덮고, 짧은 원심(1000-2000rpm·1분)으로 액체를 튜브 밑으로 가라앉힌다.

3. PCR 기기 프로그램 설정

온도 프로그램 매개변수

초기 변성: 94-98 ℃, 20-30 초, DNA 이중 체인을 완전히 분리합니다.

순환 변성: 94-98 ℃, 20-30 초, 단일 체인 상태 유지.

퇴화: 50-65 ℃, 20-40 초, 유인물과 템플릿의 특이성 결합 (퇴화 온도는 경도 PCR을 통해 최적화되어야 함).

연장: 72 ℃, 1 분/kb DNA 조각, Taq 효소 합성 새로운 체인.

순환수: 20-40회, 목표 세그먼트의 풍도에 따라 조정.

최종 연장: 72 ℃, 5-10 분, 모든 세그먼트가 완전히 연장되었는지 확인합니다.

보관 온도: 16 ℃, 2 분 (압축기의 과도한 소모를 피하고 4 ℃ 로 설정하여 기한 없이 보관하는 것을 금지합니다.)

고급 기능 설정

온도 경도: 퇴화 단계에서 온도 경도 (예: 50-65 ℃) 를 설정하고 동시에 여러 개의 퇴화 온도를 테스트하여 실험 조건을 최적화합니다.

온도 상승 속도(Ramp Rate): 온도 상승/냉각 속도(예: 3℃/s)를 조정하여 반응 시간을 단축합니다.

순환 증가(Increment): 각 순환 후 온도 또는 시간이 증가(예: 순환당 0.1 ℃ 상승)하며 Touchdown PCR과 같은 특수 실험에 적용됩니다.

프로그램 저장 및 실행

프로그램 이름을 입력한 후 저장하고 PCR 튜브를 샘플 슬롯에 넣고 열 덮개를 닫고 조입니다.

실행 중 화면을 통해 온도 및 시간을 실시간으로 모니터링할 수 있는 프로그램을 시작하여 단계 일시 중지, 건너뛰기 또는 프로그램 종료를 지원합니다.

4. 실험 후 처리

산물 분석

반응이 끝난 후 즉시 PCR 튜브를 꺼내 글리세린 겔 전영 또는 형광 검사(예: SYBR Green)를 통해 산물 크기와 농도를 분석합니다.

형광표기법을 사용할 경우 기기의 매개변수 (예: 자극파장, 이득값) 가 시약과 일치하도록 보장하여 배경신호의 간섭을 피해야 한다.

기기 유지 보수

기기를 닫기 전에 가열 모듈이 실온으로 자연적으로 냉각되어 열응력 손상을 방지한다.

정기적으로 온도 센서를 교정하여 온도 정확성을 확보합니다 (예: 표준 용해점 교정제 사용).

샘플홈과 열뚜껑을 청소하고 밀봉링이 노화되었는지 검사하며 손실된 부품을 제때에 교체한다.

다섯,전자동 PCR 기기주의사항

오염 방제

실험 전 과정은"핵산 없음"원칙을 준수하고, 전용 이액기, 총머리와 작업복을 사용하여 교차 오염을 피한다.

음성 대조 (템플릿 없음) 와 양성 대조를 설립하여 실험 체계의 신뢰성을 감시한다.

보안 작업

PCR 기기가 작동할 때 열 뚜껑을 열지 않도록 하여 고온의 화상이나 샘플의 증발을 방지한다.

부식성 액체 세정 기기의 사용을 금지하여 전자 부품의 손상을 방지하다.

문제 해결

증폭되지 않은 결과물: 템플릿 품질, 유인물 설계 또는 프로그램 매개변수 (예: 과열 온도) 를 확인합니다.

비특이성 밴드: 퇴화 온도를 최적화하거나 연장 시간을 늘려 이중합체 형성을 줄인다.

온도 변동: 엔지니어와 연락하여 기기를 교정하고 온도 균일성이 표준 (예: ± 0.2 ℃) 에 부합하는지 확인합니다.