형광정량PCR (qPCR) 기기는 분자생물학 연구, 임상진단 (예: 신종 코로나바이러스 검사) 등 분야의 핵심 장비로 정확성은 실험 결과의 신뢰성에 직접적인 영향을 미친다.보정 (보정) 은 qPCR 기기의 성능을 안정적으로 확보하는 관건적인 절차로서 정기적으로 온도제어시스템 (온도제어정밀도) 과 광학계통 (형광신호검측) 에 대해 체계적인 검증과 조정을 진행해야 한다.

1. 교정의 핵심목표

qPCR 기기의 보정은 다음과 같은 주요 성능 지표가 요구 사항을 충족하도록 설계되었습니다.

온도 제어 시스템: 온도 표시 오차 (온도와 실제 온도의 편차 설정), 온도 균일도 (반응 구멍 간 온도 차이), 온도 파동도 (시간에 따라 온도 변화), 온도 최대 과충량 (온도 상승/온도 하락 중 설정치를 초과하는 폭), 평균 온도 상승 속도 (온도 상승/온도 하락의 속도).

광학 시스템: 형광 강도 정밀도 (동일 구멍 형광 신호의 일치성), 임계값 순환수 (Ct 값) 정밀도 (다른 구멍 Ct 값의 일치성), 용해 온도 (Tm 값) 표류 (형광 강도가 절반으로 떨어질 때의 온도 편차), 형광 선형 상관 수 (형광 강도와 핵산 농도의 선형 관계).

2. 교정 전의 준비 작업

1. 환경 조건

온도: 15-30 ℃ (온도 변동이 교정 결과에 영향을 미치지 않음);

상대 습도: 20-85% RH(기계 습기 방지),

전원 공급 장치: 전원 끄기가 교정 프로세스에 영향을 주지 않도록 전압을 안정시킵니다(UPS 권장).

2. 설비와 재료

표준물질: 미토콘드리아 DNA, 리보핵산 표준물질과 같은 유증 표준물질을 사용해야 하며, 그 특성량 값 (복사수 ≥ 10 ⁶ copies/μL) 및 상대적 확장 불확정도 (≤ 5%) 는 JJF (진) 04-2020 요구에 부합해야 한다;

교정 장비: 광학 시뮬레이터 (통합 온도 센서 및 송신 광 발생기, 온도 측정 범위 0 – 120 ℃, 최대 허용 오차 ± 0.1 ℃; 송신 광 파장 360 – 780nm, 상대 광 복사 강도 조정 가능), 다중 채널 온도 검사기 (예: JDPC-96, 대응 구멍 간 온도차 측정용);

소모품: 전용 교정판(예: AB7500 ROI 교정판, 배경 교정판), 이액기(2μL, 10μL 등, 계량 검정 합격), 무분장갑(오염 방지 교정판).

3. 교정의 주요 절차

qPCR 기기의 교정 절차는 JJF (진) 04-2020"실시간 형광 정량 PCR 기기 교정 규범"을 엄격히 준수해야 하며, 주로 온도 시스템 교정과 광학 시스템 교정 두 부분을 포함하며, 다음은 AB7500 시리즈 기기를 예로 들어 구체적인 절차를 설명한다.

(1) 온도계통교정

온도는 qPCR 반응의 핵심 매개변수로 DNA 증폭 효율에 직접적인 영향을 미친다.온도계통교정은 광학시뮬레이터 (대체반응관) 를 사용하여 실제반응중의 온도변화를 시뮬레이션하고 계기의 온도제어성능을 검증해야 한다.

1. 교정 전 준비

광학 시뮬레이터를 qPCR 기기와 연결하여 아래 온도 센서와 위 형광 발사 광원과 기기 모두 열 블록의 접촉이 양호하도록 확보한다;

광학 시뮬레이터 아래에 열전도유를 발라 열전도를 강화한다;

기기 소프트웨어를 열고 [교정] 모듈을 선택하여 [온도 교정] 프로그램에 들어가십시오.

2. 교정 절차

예열: 기기의 온도를 23 ℃ 로 설정하고 예열 프로그램 (약 10 분) 을 실행하여 기기가 안정 상태에 도달하도록 합니다.

온도점 설정: 9개의 온도점 (30 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 90 ℃, 95 ℃ 등) 을 선택하고 각 온도점은 2분 동안 지속된다 (온도표시오차, 균일도, 파동도 측정에 사용).

온도 상승/냉각 과정: 50 ℃ 에서 90 ℃ 로 온도 상승 (평균 온도 상승 속도 측정), 다시 90 ℃ 에서 50 ℃ 로 온도 하락 (평균 온도 하락 속도 측정);

데이터 수집: 기기는 각 온도점의 설정 온도(Ts), 실제 온도 평균(T₁), 온도 변동(T_v), 최대 오버스트림(T_os)을 자동으로 기록합니다.

3. 결과 계산

온도 표시 오차: △T = Ts - T ₁ (요구 사항 ≤ ± 0.5 ℃);

온도 균일도: △Tu = T_umax - T_umin(T_umax는 모든 구멍의 온도 최대, T_umin은 최소 ≤ 1.0 ℃ 필요);

온도 변동: △T_v = ±(T_max - T_min)/2(T_max는 단일 구멍 온도 최대, T_min은 최소, ≤0.2℃ 요구);

온도 최대 오버스트림: △T_os = Tosmax - Ts(Tosmax는 모든 구멍 오버스트림 최대값으로 ≤3.0 ℃ 필요);

평균 온도 상승 속도: v_up = (TB - TA)/tut (TB는 90 ℃ 온도 점 평균, TA는 50 ℃ 온도 점 평균, tut는 온도 상승 시간, 요구 ≥ 4 ℃ / 초);

평균 냉각 속도: v_down = (TB - TA)/tdo (tdo는 냉각 시간, ≥ 3 ℃ / 초 필요).

(2) 광학 시스템 교정

광학 시스템은 Ct 값과 핵산 농도의 정량 결과에 직접적인 영향을 미치는 형광 신호를 검사합니다.광학 시스템 보정은 AB7500 ROI 보정판과 같은 전용 보정판을 사용하여 형광 검출기의 감도와 신호 일관성을 조정해야 합니다.

1. 배경 보정

목적: 기기의 본바닥 형광(예를 들어 전자신호, 플라스틱 소모품 오염)의 간섭을 제거한다.

단계:

(1) 배경교정판을 꺼낸다 (응축수를 피하기 위해 실온에서 5분 방치해야 한다).

(2) 교정판을 기기에 장착하고"배경교정"프로그램을 실행한다 (약 30분).

(3) 소프트웨어는 배경 형광 신호를 자동으로 기록하고 배경 보정 파일을 생성합니다 (후속 실험에서 자동으로 공제).

2. ROI(관심 영역) 조정

목적: 반응판의 공위를 계기검측기에 비추어 각 공의 형광신호가 정확하게 채집되도록 확보한다.

단계:

(1) ROI 교정판을 꺼낸다(표준판 또는 쾌속판, 5초 소용돌이 및 2분 소요).

(2) 교정판을 기기에 장착하여"ROI 교정"프로그램을 실행한다;

(3) 소프트웨어는 각 필터의 이미지를 자동으로 촬영하여 ROI 마스크를 생성합니다 (각 구멍 주위에 녹색 원이 표시되어 교정에 성공했음을 나타냄).

(4) 이미지가 과포화(구멍 내 형광이 너무 강함)되면 2048에서 1024로 감소하는 등 노출 시간을 조정하여 이미지를 다시 수집해야 한다.

3. 광학 교정

목적: 광학 시스템의 물리적 효과(예를 들어 필터의 스펙트럼 응답)를 보상하고 형광 신호의 정확성을 확보한다.

단계:

(1) "옵티컬 보정" 프로그램을 선택하여 ROI 보정 파일을 로드합니다.

(2) 프로그램 실행(약 10분), 소프트웨어는 형광신호의 스펙트럼 특징을 자동으로 분석하여 광학교 정파일을 생성한다.

4. 염색약 보정

목적: 서로 다른 염료(예를 들어 FAM, VIC, ROX)의 형광 신호 정확성을 검증하고 다염료 실험의 신뢰성을 확보한다.

단계:

(1) 염료 교정판 제거(CY3, CY5, FAM 등 다양한 형광 염료 포함);

(2) 교정판을 기기에 장착하여"염료 교정"프로그램을 실행한다;

(3) 소프트웨어는 각 염료의 형광 스펙트럼을 자동으로 수집하여 염료 교정 파일을 생성합니다 (후속 실험에서 염료 신호를 자동으로 식별).

(3) 결과 기록 및 인증서

교정이 완료되면 다음을 포함하여 CNAS 인증 교정 인증서를 발급해야 합니다.

(1) 계기기본정보 (모델, 일련번호, 생산업체);

(2) 환경조건(온도, 습도, 시간)을 교정한다.

(3) 교정 결과 (온도 표시 오차, 균일도, 광학 시스템 정밀도 등);

(4) 교정인원과 심사인원의 서명;

(5) 교정기관 자질(CNAS 인정번호).

4. 교정의 주의사항

1.교정주기

12개월마다 전면 교정(JJF (진) 04-2020 요구 사항 충족)을 권장합니다.

하루 10회 이상 실행하는 등 사용 빈도가 높거나 임상 진단과 같은 핵심 애플리케이션에서 6개월에 한 번으로 단축할 수 있습니다.

기기를 이전, 수리 또는 교체한 후 핵심 부품 (예: 가열 블록, 검측기) 을 다시 교정해야 한다.

2. ProSupport

교정은 공장 엔지니어 또는 자격을 갖춘 제3자 기구 (예: 톈진시 계량감독검측과학연구원) 가 집행하여 SOP (표준조작절차) 에 부합하도록 확보해야 한다;

비전문가가 스스로 기기 매개변수 (예: 온도 설정, 광학 필터) 를 조정하는 것을 금지하여 교정 결과에 영향을 주지 않도록 한다.

3. 교정 후 검증

교정이 완료되면 입자 DNA 표준물질과 같은 표준물질 검증 실험을 실행하고 Ct 값의 반복성(변이계수 ≤3%)과 선형 상관계수(R²≥0.99)를 측정해 교정 효과를 확보해야 한다.

검증 결과가 요구에 부합되지 않으면 다시 교정하거나 공장에 연락하여 수리해야 한다.

5. 흔히 볼 수 있는 문제와 해결

1.온도 균일도 부적합

원인: 균열 블록 오염 (예: 잔류 PCR 산물), 온도 센서 노화;

해결: 균열 블록 (무수 에탄올로 닦기) 을 청소하고 온도 센서를 교체합니다.

2. 형광신호의 강도가 낮다

원인: ROI 교정 실패(구멍 비트 매핑 오류), 배경 형광 과다;

해결: ROI 교정을 다시 수행하고 배경 교정을 실행합니다 (배경 교정 보드 교체).

3. Ct값 변이가 크다

원인: 온도 파동도가 기준치를 초과(예를 들어 가열 블록이 불안정함), 형광 검측기의 민감도가 떨어진다;

해결: 가열 블록의 온도 안정성 검사 (다중 채널 온도 검사기로 측정), 형광 검사기 교체.

6. 총화

형광정량PCR기의 교정은 실험데터의 정확성과 믿음성을 확보하는 관건적인 절차로서 업종표준 (예를 들면 JJF1527-2015, JJF (진) 04-2020) 을 엄격히 준수하고 정기적으로 온도제어시스템과 광학시스템을 교정해야 한다.교정과정에서 환경조건, 전문지원과 결과검증에 주의를 돌려 계기의 성능이 실험요구에 부합되도록 확보해야 한다.규범화된 교정 절차를 통해 실험 오차를 효과적으로 줄이고 qPCR 결과의 정확성과 중복성을 높일 수 있다.