올림푸스 형광 현미경의 해부도

2018/7/26 7:52:45 발표자: admin

거시적 샘플 특징에 기반한 기타광학 현미경패턴에 비해 위상 경도, 광 흡수 및 이중 굴절과 같은 형광 현미경은 형광 발사의 특성만을 기반으로 단일 분자 종류의 분포를 달성 할 수 있습니다.따라서 형광현미경을 사용하면 특정 형광단으로 표시된 세포 내 성분의 정확한 위치와 그것들과 관련된 확산 계수, 운반 특징 및 기타생물분자의 상호작용.또한 국부 환경 변수에 대한 형광의 현저한 호응으로 인해 살아있는 세포와 조직에서 pH, 점도, 굴절률, 이온 농도, 막 전위 및 용제 극성을 연구 할 수 있습니다.

이전 형광 현미경 구성은 고전적인 명장 또는 암장 투사 (투과광）광학 시스템필터를 통과하는 자극 광선을 샘플 평면에 초점을 맞춥니다.물경을 통해 형광 발사 및 대량의 자극 조사를 수집하고, 두 번째 필터를 통해 안경의 광란에 투사하여 중간 이미지를 형성한다.빛을 자극하는 강도는 일반적으로 형광 발사보다 몇 단계 더 크기 때문에 이러한 초기 투과광 현미경의 샘플 뷰는 일반적으로 명암비가 매우 낮고 산란 자극으로 가득 찬 배경에 중첩됩니다.고수치 공경 유침암장 집광기를 사용하여 고경사 방위각으로 샘플을 비추는 것은 대부분의 배경 소음을 제거하는 데 도움이 되지만 저수치 공경 물경 외에 충분한 조명을 제공하지 못했다.이미지 해상도가 낮고 밝기가 매우 낮습니다.

형광 현미경과 입사광 (반사광또는 낙사) 조명은 1920년대 후반에 개발되어 불투명한 야금 샘플에서 형광 발사를 관찰하는 데 사용되었다.그들의 명장대응물과 마찬가지로 이런 반사광형광계기는 반반사식분속기를 사용하는데 그 총효률은 약 25% (매번 거울을 통과한후 50% 의 조도를 잃는다.) 이다.그러나 반사광 형광 현미경은 집광기로서의 높은 수치 공경 물경의 장점을 가지고 있으며 비슷한 수치 공경에서 조작되는 투사광 현미경보다 더 높은 수준의 이미지를 생성할 수 있다.또한 반사 재물경 (고수치 공경에서) 의 잡다한 자극광은 겨우 몇 퍼센트 감소한다.반사광 현미경에서의 물경의 이중 작용도 조준 임무를 현저하게 간소화시켰다.물경만 견본에 초점을 맞추어 조명장과 시야를 구축하여 입사된 자극광과 관찰된 형광발사가 현미경광학계렬을 통과하는 동일한 경로를 따르도록 하였다.

1930년대 중반에 준중형 수은 증기와 제논호 방전등이 개발되었을 때, 조명 광원의 기술 진보는 반사광 형광 (적어도 김상학에 대한) 의 전환을 추진했다.이 기간 동안 유색 유리와 젤라틴 필터도 더욱 복잡해져 할로겐 텅스텐 램프를 사용하여 파란색과 녹색 가시광선으로 자극 된 형광 염료를 적용 할 수 있습니다.반사 방지 코팅과 개선된 유리 조제법은 1940 년대에 대물경 설계의 큰 개선을 초래했지만 입사 광 형광 현미경 개발의 근본적인 기여는 1948 년에 러시아 광학 과학자 인 Eugeny Brumberg에 의해 도입 된 2 색 분광경 (이방향 색경이라고도 함) 도입되었습니다.이 혁신은 반사광 현미경에 일반 반반사경을 사용하는 데 내재된 빛 손실 문제를 극복했다.반사광 형광현미경은 1960년대 후반에 Johan S. Ploem에 의해 널리 상업화되었으며, 여러 개의 교환 가능한 광학 모듈과 다양한 형광현미경 필터 조합을 포함하는 Wild-Leitz Ploem Opak을 개발하는 데 중요한 역할을 했습니다.

낙사 형광 현미경의 기본 전략

반사광 형광 현미경의 절대다수는 비상간 광원의 광장 연구에 사용되는 현재 선택 방법과 레이저 스캐닝 공초점과 다광자 기기로 진행되는 것들이다.이런 류행적인 형광현미경모식은 입사광형광이라고도 하는데 반사형광 또는 간단한 락사형광이다.전형적인 현대 반사광 형광 현미경도 그림 1과 같이 각종 대비도 강화 모드에서의 투사광 관찰을 갖추고 있다.현미경은 전하 결합 부품 (CCD) 에 결합된 세 개의 관찰 헤드를 포함하고 있으며, 두 개의 조명원이 있는데, 하나는 투과광, 다른 하나는 관찰 관찰 (각각 텅스텐-할로겐과 수은호 방전) 이다.이 디자인의 현미경은 반사광 형광과 투과광 위상 대비도, 미분 간섭 대비도(DIC), 편광 또는 호프만 변조 대비 관찰을 조합하거나 교대할 수 있다.

모든 형광 현미경의 기본적인 특징은 샘플을 자극하는 메커니즘을 제공하는 것이다. 선택적으로 필터링된 조명을 가진 다음 두 번째 필터를 사용하여 더 약한 형광 발사를 분리하여 어두운 배경에서 큰 민감도로 이미지를 형성한다.많은 실험에서, 생물 샘플 중의 국부 탐침 농도는 매우 낮고, 단지 작은 부분의 자극 빛만이 형광 물질에 흡수된다.또한 일정량의 빛을 흡수할 수 있는 형광단에서는 2차 형광을 내는 백분율이 더 낮다.얻은 형광 발사 밝기 수준은 조명의 밝기 수준보다 3~6 단계 낮을 것입니다.따라서 형광현미경의 기본적인 문제는 샘플의 효율적인 조명을 생성하는 동시에 더 강한 조사대와 효과적으로 분리된 약한 형광발사를 포획하는 것이다.현대 형광 기기에서 2색 빔의 작용과 특성을 바탕으로 자극과 발사 요구를 조화롭게 하는 필터의 조합을 통해 이러한 조건을 만족시킨다.

그림 2는 녹색 영역(550nm)에서 적색(620∼660nm) 파장의 형광을 자극해 방출하는 형광단의 가상 시료가 포함된 반사광 형광 현미경 유치색 분속기(거울) 기능 뒤의 원리를 요약한 것이다.가시 스펙트럼.고강도 광원은 조명기를 통과하고 가장 먼저 적절한 자극 대역을 선택하는 필터 (EF로 표시; 그림 2 (a) 를 만나는 넓은 범위의 자극 파장을 높은 통량 밀도 (일반적으로 대부분의 자외선과 전체 가시 스펙트럼을 커버) 로 출력합니다.이 경우 필터는 510과 560나노미터 사이의 빛을 고효율로 통과하지만 다른 파장도 더 작은 정도로 통과할 수 있다.자극된 빛은 이어서 이색경 (그림 2의 DM) 에 도달하여 물경 뒤쪽 구멍에 반사되어 샘플을 비추는 원추형 조명을 형성한다.투톤 렌즈는 광선 회로에 위치하며 45도 각도로 490과 565nm 사이의 파장 (그림 3 참조) 을 선택적으로 반사하는 동시에 더 짧고 더 긴 파장을 전송하도록 설계되었습니다.

그림 3에는 자극 조명과 그림 2의 형광 방출을 분리하는 필터를 조합하는 투사 곡선이 나와 있습니다.자극 필터 스펙트럼 (적색 곡선) 은 510 나노미터와 560 나노미터 사이에서 높은 수준의 투과율 (약 80%) 을 보여줍니다.중심파장(CWL) 535나노미터.2색 렌즈 (노란색 곡선) 는 스펙트럼 영역의 파장을 반사하여 상대적으로 높은 효율로 더 높고 더 낮은 파장을 통과합니다.2색 대칭복사 커브의 백분율 투과율은 100% 반사에 해당합니다.490 나노미터와 570 나노미터 사이의 투과 분포에서의 현저한 감소 (반사율의 피크를 나타냄) 는 자극 필터에서 90도 각도로 샘플에 들어가는 파장 대역을 반사하는 데 사용됩니다.광학 시리즈의 후면 구성 요소, 즉 발사 또는 장벽 필터 (흰색 곡선) 는 노란색, 주황색 및 빨간색 가시광선을 가진 590 나노미터 이상의 파장을 투과합니다.다양한 오버레이된 스펙트럼의 투과와 반사 대역 사이의 경계는 반사와 투사 파장이 거의 * 분리되도록 가능한 한 가파르게 설계되었습니다.2색경 스펙트럼에서 정현이 상승하고 하강하는 첨봉이 나타나는 도안은 박막이 퇴적되는 과정의 흔히 볼수 있는 효과로서 끊임없이 울리는것이라고 한다.이 필터 조합의 성능은 매우 뛰어나 박막 간섭 필터 기술의 빠른 발전을 분명히 증명했다.

좁은 대역폭의 빛만 2색 렌즈에 반사되기 때문에 자극 필터를 통해 490나노미터보다 짧고 565나노미터보다 긴 조사 파장도 2색 렌즈를 통해 전송하려고 한다. 위의 빛과 같다.그림 2(a)에서자극된 빛의 반사는 100% 유효하지 않으므로 소량의 녹색 빛은 2색 거울을 통해 반사되지 않습니다.또 565 이상의 파장이나 490나노미터 미만의 모든 빛이 거울을 통과하는 것은 아니다.이런 빛의 일부분은 거울에 의해 물경을 통해 견본에 반사된다.

녹색 빛에 의해 자극 된 샘플의 형광 방출 (주로 적색 파장) 은 물경이 모여 2 색 렌즈와 장벽 필터 (그림 2 (c) 에서 마감 된 빛 이상) 를 통과합니다.장벽 필터 (그림 2에 표시된 BF는 파장이 590 나노미터 이상인 빛만 현미경 고글 및/또는 탐지기에 도달할 수 있도록 특별히 설계되었습니다.이 작업에 사용할 때 장벽 필터는 샘플에서 반사된 (그리고 성공적으로 2색 렌즈를 통과한) 자극 광파 길이가 검출기에 도달하는 것을 효과적으로 방지합니다.그러나 시료에서 반환된 대부분의 자극 파장은 2색 렌즈 (그림 2 (c) 의 마감 광선 이하의 빛) 에 의해 자극 필터와 발광기에 반사됩니다.그림 2와 3에 표시된 필터 구성의 순효과는 강도가 훨씬 높은 자극광과 더 약한 형광 발사를 분리하는 것이다.모든 경우 그림과 같이 형광 현미경에 관련된 필터의 마감 수준은 아니지만 파장 범위 밖의 일부 빛을 침투시킬 수 있습니다.그림 2(b)에는 유효한 반사광 형광 현미경에 필요한 광학 경로와 정책 필터 배치를 설명하는 전체 이벤트 시퀀스가 그래픽으로 표시됩니다.

수직형광조명기

현대 형광 현미경의 핵심은 통용 반사광 수직 조명기로, 관찰 관찰관과 휴대용 물경의물경그림 1과 그림 4와 같이 변환기 사이입니다.조명기는 먼저 현미경 대물경을 통해 샘플의 방향으로 빛을 향하게 한 다음 동일한 대물경을 사용하여 샘플에서 나오는 빛을 캡처하여 샘플에 강도를 배치함으로써 고광선으로 발생하는 빛을 유도하도록 설계되었습니다.이런 유형의 조명 전략은 몇 가지 장점을 가지고 있다.현미경 물체경은 우선 잘 교정된 집광기로 한 다음 영상 형광을 수집하여 발사하여 고글이나 카메라 검측 시스템에 전송할 수 있도록 한다.따라서 대물렌즈는 항상 각 기능에 대해 올바르게 정렬됩니다.또한 샘플에 의해 산란되거나 반사되는 대부분의 자극 광 (360도 각도에서) 은 형광이 비치는 것과 같은 유리에 직접 투사되는 것이 아니라 렌즈 앞의 렌즈 소자에서 멀리 떨어져 있습니다.이런 효과는 정면조명이라고 불리며 특히 두꺼운 표본에 적용된다.이후 조사된 표본 영역은 관찰된 동일한 영역으로 제한되며 조명과 빛 수집은 물경의 전체 수치 공경을 이용할 수 있다.

수직 조명기의 원단에는 고강도 아크 방전 또는 필라멘트 기반 백열등 광원이 포함된 램프 상자가 있습니다 (그림 4 참조).인기 있는 조명 광원은 고압 100와트 수은 아크등 (HBO, 일반적으로 연소기라고 부른다) 이지만 제논과 금속 할로겐화물 아크등, 레이저와 할로겐화 텅스텐 백열등도 이런 목적으로 사용할 수 있다.광원에서 방출되는 빛은 스폿 렌즈 시스템에 의해 초점을 맞추며 현미경 축에 평행하고 수직인 조명기 내부를 따라 행진합니다.그림 4에 표시된 발광기 설계에는 다중 어셈블리 컬렉터 렌즈 시스템이 포함되어 있지만 근적외선 및 자외선 영역의 색차 보정을 개선하기 위해 비구면 렌즈 컴포넌트도 구현됩니다.적외선 파장을 제거하거나 억제하기 위해 설계된 열 필터는 램프 자체 내부 또는 인접한 수직 조명기 뒤쪽의 램프 장착 받침대에 배치됩니다.또한 일부 현미경은 이중 주파수 또는 다중 주파수 인센티브 밸런서 램프 상자 근처의 시스템 (그림 4와 그림 8 참조) 을 포함하여 조명기 반대편에 포함된 형광 필터 그룹의 성능을 미세 조정하기 위해 인센티브에 필요하지 않은 파장을 선택적으로 필터링합니다.

수직 조명기에서 조명 상자 근처에 있는 것은 시스템을 통과하는 빛의 총 강도를 조절하고 형광 퇴색 또는 빛 표백을 줄이는 데 사용할 수있는 중성 밀도 필터 세트입니다.이러한 필터는 일반적으로 샘플의 형광을 관찰하면서 광선을 빠르게 삽입하고 광선에서 제거할 수 있도록 슬라이더 프레임에 설치됩니다.Khler 조명을 구축하기 위해 수직 조명기는 중앙에 놓을 수 있는 조리개와 시야 광맹의 조합을 포함하고 있으며, 둘 다 가변적인 조리개 공경을 가지고 있어 장소의 크기와 조명 강도를 결정한다.수직 조명기 하우징의 각 바깥쪽에 위치한 몇 쌍의 다이얼을 통해 공경과 장광맹의 대중 및 조리개 사이즈를 조절한다.일부 설계에서는 조명기를 통과하는 광량을 극대화하기 위해 전체 조리개 어셈블리를 광선로에서 제거하는 슬라이더 다이얼을 제공합니다.다른 현미경은 고정 크기의 바늘구멍을 포함하고 슬라이더에 장착되어 광로를 삽입할 수 있으며 조명장을 크게 제한할 수 있으며 빛 표백 후 형광 회복 (FRAP) 조사와 같은 특수 응용 프로그램에 적용됩니다.

수직 조명기 광학 시리즈의 장광맹과 광맹 다음은 장렌즈로, 빛을 확산시키고 콜러 조명을 세우기 위해 충분한 조명장을 생성하는 데 필수적이다.필드 미러 이후 모든 현대 수직 조명기는 수동 스위치 제어가 있는 광 브레이크를 포함하고 있으며, 형광을 관찰하거나 기록하지 않을 때 강한 자극 빛이 필터 그룹과 샘플에 도달하는 것을 막는다.셔터는 형광현미경의 관건적인 특징이다. 왜냐하면 견본의 련속적인 조사는 빛표백으로 인한 발사를 뚜렷이 감소시킬수 있지만 고강도의 빛은 활세포에 대해 건강하지 못하기때문이다.또한 셔터는 아크 방전등을 활성 상태(예열 시간 감소)로 유지하면서 투과광으로 표본을 순간적으로 검사한다.형광 현미경은 일반적으로 전자 셔터를 갖추고 있어 조명을 신속하게 원격으로 제어할 수 있다.자외선 차단 커버(그림 4에 표시된 호흡 매트는 셔터가 열릴 때 작업자가 잠재적으로 위험한 단파 자외선 복사를 실수로 누설하지 않도록 조명기 케이스 앞부분에 설치된다. 관찰 시 가스 호출로부터 표본을 보호함으로써 커버는 이중 역할을 한다.

몇 가지 수직 조명기 설계는 형광 편광 연구에 사용할 수있는 직사각형 편광기 프레임에 사용되는 슬롯을 제공합니다.대부분의 경우 편광기를 필드 거울 뒤의 조명 광로 (공멍 평면에서 멀리 떨어져 있음) 에 삽입하지만 광 브레이크 앞에 있습니다 (그림 4 참조).편광기는 예정된 투사 방위로 고정되거나 기어 세트에 장착되어 썸휠을 사용하여 투사 축의 방향을 변경할 수 있습니다.편광기는 슬라이딩 프레임에 설치되므로 사용하지 않을 때 광선로에서 쉽게 제거할 수 있습니다.동봉된 분석기(형광 각방향 이성 측정에 필요한 두 번째 편광기)는 필터 블록 회전탑 위의 수직 조명기 또는 특별히 설계된 편광 현미경 중간관에 설치할 수 있다.보조관은 일반적으로 그라데이션된 회전 편광기 유닛을 삽입하여 편광기와 현미경 광축에 대한 분석기의 투과 방위의 정확한 위치를 확보할 수 있다.

수직 조명기의 후면에는 형광 필터 조합을 포함하는 광학 블록을 포함하는 회전 회전대 또는 슬라이딩 브래킷이 있습니다.특정 형광 필터를 사용하여 이미지를 조합해야 할 경우 필터 블록은 광학 시리즈로 회전하거나 슬라이드합니다.단일 블록에는 샘플의 조사와 특정 파장의 형광 발사를 최대한으로 향상시키기 위해 샘플의 조사를 향상시키고 포획하기 위해 일치하는 자극 및 발사 필터 세트와 2색 분광 렌즈가 포함되어 있습니다.옵티컬 블록 회전탑과 슬라이더 브래킷은 3~6개의 개별 블록을 마운트할 수 있으며, 그 중 하나는 광선로에 있고 다른 블록은 임시 스토리지에서 회전하거나 슬라이드아웃할 수 있습니다.두 개 이상의 형광 프로브로 표시된 샘플을 관찰할 때 이러한 첨부 파일은 형광 필터 그룹 사이에서 빠르게 변환 될 수 있습니다.형광 조명기가 장착된 현미경에서 투과 조명을 사용하면 회전대나 슬라이더 브래킷의 슬롯에 있는 가상 광학 블록을 조립하여 촉진할 수 있다.가상 블록은 셔터가 열려 있을 때 발사를 차단하지만 필터가 포함되지 않으며 물체에서 관찰관을 가로막지 않고 통과할 수 있습니다.

표준 모듈식 직립 현미경에서 수직 조명기는현미경프레임과 관찰관 사이 (그림 1 참조).많은 제조업체는 편광기, DIC 프리즘 또는 기타 액세서리를 위해 조명기와 고글 셀 사이에 삽입할 수 있는 중간 파이프를 제공합니다.현대 현미경 프레임워크는 일반적으로 컴퓨터 보조 설계 노력의 결과로 현저한 감진과 강화된 인체공학적 특징을 초래한다.금속 기반 세라믹 및 알루미늄 복합 재료와 같은 합성 재료는 프레임의 정적 및 열 강성을 크게 향상시켜 기기가 약한 형광 발사를 위해 장시간 * 진동을 제거하는 첨단 형광 기술의 가혹한 요구를 견딜 수 있도록 합니다.

Kruhler 형광 현미경 조명

형광 수직 조명기에서 광원은 가는 실이나 아크 방전 플라즈마 공이 스폿 렌즈의 주 초점 근처에 위치하도록 배치됩니다.Krhler 조명에서 라이트 스폿 렌즈는 전체 조명을 강화하기 위해 크게 증가하는 보조 광원 역할을 합니다.Khler 조명의 주요 요구 사항 중 하나는 필라멘트 또는 아크의 이미지가 대물경의 후초점 평면에 최종 투사되어야 한다는 것입니다. 반사 광선이 방출되는 동안 그것은 (일반적으로 높은 수치의 공경) 집광기의 두 배입니다.이상적인 상황에서 광원은 전체 물경의 공경을 채우여 복사강도를 크게 하고 균일한 조사장을 산생해야 한다.경우에 따라 핫스폿).그러나 필터를 확산시키면 조도도 떨어지기 때문에 가능한 한 사용을 피해야 한다.

반사광 Krhler 조명 (그림 5에서 도식적으로 표시됨) 에서 광원의 이미지는 집광렌즈에 의해 수직 조명기에 있는 공경 광맹 필름에 초점을 맞춘다.이 광맹은 물경의 뒷구멍과 등호 또는 등사와 공용 멍에 평면을 공유하기 때문에 비치는 장공경의 크기를 확정한다.광원, 수직 조명기 공경 광맹과 물경 후초점 평면 (렌즈) 이 함께 공멍 평면의 조명 그룹을 형성한다.투과광 현미경의 경우와 달리 공경 조리개와 광원은 물리적으로 이 위치에 있는 것이 아니라 물경 (집광기 역할) 뒤의 공경 평면에 영상화된다.이 구성의 추가 이점으로 물경이 자극 조사를 제공하거나 모인 형광 발사로 이미지를 형성할 때 홍채 조리개와 같은 모든 장애물이 광로에서 제거됩니다.공경광맹을 켜거나 끄면 조명장의 크기를 변경하지 않고 번잡한 빛을 제어하고 조명의 강도 (수치 공경) 를 조절할 수 있습니다.이미지에서 공경 광선의 조정은 밝기와 대비도에 영향을 줄 수 있습니다.

반사광 Krhler 조명의 공멍 평면의 이미지 또는 필드 그룹은 필드 광맹, 샘플 표면 및 중간 이미지 평면으로 구성됩니다.따라서 즉석 광선이 샘플 평면에서 초점을 맞출 때 광원의 이미지는 균일한 조명장을 제공하기 위해 초점에서 현저하게 제거됩니다.시야 광맹은 관찰된 영역의 조명 강도에 영향을 주지 않고 조사장의 크기를 제어합니다.실제로 필드 광맹 개구 크기는 이미지 명암비를 높이고 직접 관찰되지 않은 영역의 빛 표백 정도를 줄이기 위해 가능한 한 작아야 합니다.대부분의 아크 방전과 필라멘트 광원에서 발생하는 조명의 강도가 고르지 않지만 Khler 조명은 샘플장을 균일하게 비출 수 있습니다.현미경을 올바르게 구성하면 대물경의 후초점 평면 * 이 밝게 비추어 가장자리에서 가장자리까지 균일하고 밝은 영역을 제공합니다.이상적인 상황에서 Khler 조명은 집합된 파전으로 샘플을 목욕시키는데, 각 파전은 광원의 단독 점으로 형성되며, 이 점들은 집광기 공경에 영상화된다.올바르게 구성된 형광 현미경에서 결과는 의 이미지 명암비와 해상도입니다.이상적인 상황에서 한 조의 회합된 파전으로 견본을 목욕시키면 매 파전은 모두 영상으로부터 집광기의 공경에 이르는 광원의 부동한 점에서 산생된다.올바르게 구성된 형광 현미경에서 결과는 의 이미지 명암비와 해상도입니다.이상적인 상황에서, 한 조의 모인 파전으로 샘플을 목욕시키고, 각 파전은 영상에서집광경구멍 지름의 광원의 다른 점에서 생성됩니다.올바르게 구성된 형광 현미경에서 결과는 의 이미지 명암비와 해상도입니다.

라이트 및 등대

형광 현미경에서의 엄격한 정량 분석에 대해 샘플의 조사는 반드시 전체 시야에서 시간적, 공간적으로 일정해야 한다.시간에 따른 불안정성은 일반적으로 전원 출력의 변화로 인해 발생하는 램프 복사의 파동을 반영한다.반면 아크 램프에서 자주 나타나는 공간 교란은 플래시라고 불리는 현상에서 비롯된다. 플라스마 공이 전극에서 왔다갔다하기 때문이다.깜박임은 일반적으로 전원 파동, 전극 저항의 작은 변화 또는 기계적 진동에 의해 발생합니다.유행하는 할로겐화 텅스텐 램프와 같은 필라멘트 기반 광원은 안정된 전원을 사용하는 고정 직류 전기에서 작동할 때 매우 안정적입니다.일반적으로 광원은 그 스펙트럼 함량, 물경 뒤의 공경 구역에 비해 필라멘트 크기, 공간과 시간 안정성 및 필드 조명의 균일성을 선택해야 한다.또한 자극 필터가 통과하는 좁은 대역 파장은 총 발광기가 출력하는 매우 작은 부분만 포함하기 때문에 광원의 강도에 특히 주의해야 합니다.

형광 현미경에 사용할 광원을 선택하는 주요 고려 요소는 연구한 것과형광 염료의 양자 생산율과 흡수와 관련된 자외선과 가시광선 스펙트럼 분포.또한 광원은 사람의 눈, 전통적인 필름, 광전 배율 튜브, 향상된 비디오 튜브 또는 디지털 카메라 시스템을 포함하여 이미지를 캡처하는 데 사용되는 탐지기의 감도와 호환되어야 합니다.또한 조명 모드에 따라 선택이 달라집니다.아크 방전 또는 텅스텐-할로겐 소스를 사용하여 와이드 필드 형광 현미경의 요구 사항을 충족하고 공초점 및 다광자 현미경은 다양한 레이저 시스템에 적응해야합니다.텅스텐과 텅스텐 - 할로겐 백열등의 사용은 대부분의 발사가 스펙트럼의 적색 및 적외선 영역에서 발생하며 대부분의 형광 덩어리는 자외선, 청색 및 녹색 파장에 의해 자극되기 때문에 제한된 성공을 거두었습니다.또한 아크 방전등의 빛 출력은 일반적으로 투사 광선에 사용되는 12볼트 석영 할로겐 램프보다 10~100배 밝다.광시야 형광 현미경의 인기있는 광원은 수은 아크 조명이며 일반적으로 기본 모델 현미경 구성에 포함됩니다.어떤 경우에는 제논과 금속할로겐화물 호광등을 사용하지만 이런 것들은 일반적으로 스펙트럼과 강도 분포가 특정 형광단의 요구와 일치하는 특수한 상황에 국한된다.

수은과 제논 램프는 램프 케이스의 물리적 크기와 가스를 제외하고 디자인이 유사합니다.수은등에는 기화 원소인 수은도 함유된 석영 유리 전구에 고압으로 밀봉된 두 개의 전극이 포함되어 있다.전원이 켜졌을 때, 일련의 고압 펄스는 전극으로 보내져 작은 부분의 수은 가스를 이온화하고 불을 붙인다.소제 후, 전압이 낮아지고 이온화 기체는 전류를 적재하여 두 전극 사이에 형성된 플라스마 구를 생성하는 데 쓰인다.등이 작동하는 동안 수은의 증발은 유리 전구 안에서 대량의 열과 압력을 발생시켜 결국 고강도의 빛을 발생시킨다.수은 아크 램프에서 발생하는 빛은 자외선과 가시 스펙트럼 범위 내에서도 연속적이며 365400440546 및 580 나노미터의 이산 파장에 집중됩니다.자외선에서 적외선에 이르기까지 제논등은 전체 스펙트럼 범위 내에서 더욱 균일한 강도 분포를 가지고 있다.형광 염료의 선택은 형광 현미경의 적당한 광원을 확정하는 데 매우 중요하다.일부 형광프로브는 두드러진 수은선과 겹치는 자극대를 갖고있고 기타 형광프로브는 제논등의 더욱 균일한 분포의 조사의 혜택을 받는다.

형광 현미경에서 호광등의 정확한 조준은 콜러 조명을 실현하고 형광 이미지의 명암 구역을 피하는 데 매우 중요하다.따라서 램프박스의 품질은 일반적으로 정확한 램프 조준의 안정성과 조준을 유지하는 데 사용되는 조절 다이얼의 효율을 통해 판단할 수 있다.램프 받침대는 램프 쌍 나사를 장착하여 원홍색과 적외선의 긴 파장을 차단하기 위해 호형 이미지를 물경 뒷구멍에 가운데로 배치해야 하며, 램프 상자에는 적외선 필터가 포함되어 있어야 합니다.일부 조명 상자에는 Schott BG38과 같은 내장 빨간색 억제 필터가 있거나 특정 응용 프로그램에서 시야를 통해 볼 수 있는 빨간색 배경이 있는 것을 제거하기 위해 이 필터에 사용되는 슬롯이 설계되어 있습니다.또한 램프 상자 자체에 유해한 자외선 파장이 누출되어서는 안 되며, 작동 중 의도치 않게 셸을 열면 자동으로 불을 끄기 위한 스위치가 포함되어야 한다.그 후, 램프는 작동 중에 가능한 연소기의 폭발을 견딜 수 있도록 충분히 견고해야 한다.

형광 현미경 응용의 광범위한 다양성은 일반적으로 특정 형광 덩어리 및 이미징 조건의 요구를 충족시키기 위해 일련의 광원이 필요합니다.일부 경우 초민감 카메라 시스템과 조합하려면 매우 낮은 방사선이 필요할 수 있으며 다른 연구에서는 살아있는 세포를 죽이거나 형광단을 선택적으로 표백하기 위해 강한 레이저 자극이 필요할 수 있습니다.파장은 일반적으로 스펙트럼의 전체 가시 영역과 자외선과 적외선의 부분을 뛰어넘어야 한다.단일 라이트로는 이러한 다양한 조명 요구 사항을 충족할 수 없으므로 제조업체에서 제공하는 어댑터는 두 개 이상의 램프를 단일 현미경에 동시에 연결할 수 있습니다.

형광 필터 조합

앞에서 말한바와 같이 수직조명기를 통과하는 렌즈와 광맹의 빛은 결국 광학블록에 수용되는 자극려과기를 만나게 되는데 이 광학블록은 조명기 광로와 현미경 광학계통 사이의 축방향교차점과 일치하도록 위치확정된다.자극 필터는 램프에서 발생하는 넓은 스펙트럼에서 좁은 대역 파장을 선택하여 2색 렌즈로 전달하고 2색 렌즈는 물경을 통해 빛을 반사하여 샘플에 비춘다.고정된 안경의 광맹에서 이미지가 형성되기 전에 물경이 모인 형광 발사는 다시 이색경과 발사 또는 장벽 필터를 통과한다.와이드 필드 형광 현미경에서 주파수 대역을 분리하는 데 사용되는 일반적인 필터에는 스테인드 글라스 필터와 간섭 필름 필터 (또는 둘 다의 조합) 가 포함됩니다.형광 현미경 조명 및 이미징 시나리오의 각 단계에 적합한 필터를 결정하면 혼동이 발생할 수 있습니다. 많은 필터 제조업체와 관련되어 있기 때문에 각 필터 제조업체는 형광 문헌에 고유한 알파벳 숫자 명명법을 제공합니다.

그림 7 에는 전형적 인 설명 이 나와 있다형광 자극 블록의 해부 구조와 2색 렌즈, 자극 및 장벽 필터의 관련 스펙트럼 윤곽.필터 블록은 일반적으로 제조업체에서 제공하는 사용자 정의 도구로 조립되므로 운영자는 필터와 투톤 렌즈를 교환할 수 있습니다.자극 및 장벽 필터는 고정 클립, 광학 접착제 또는 원형 나사 장착 받침대를 통해 고정됩니다 (그림 7 참조).일반적으로 광학 블록을 열지 않고 필터를 제거할 수 있습니다. 이 필터는 평평한 외부 표면의 오목한 구멍 위에 있기 때문입니다.이색 거울을 교체하는 것은 더욱 어렵습니다. * 블록을 분해해야 내부로 들어갈 수 있습니다.대부분의 블록 부분은 45도 대각 이음매로 주조되어 내부를 보호하고 적절한 각도로 2색 거울을 지탱함으로써 이중 작업을 수행할 수 있습니다.블록 부분을 고정한 고정 부품 (핀 또는 작은 나사) 을 분리한 후 고정 클립을 풀거나 이동하여 거울을 제거한 다음 블록에서 조심스럽게 제거할 수 있습니다.간섭 코팅은 일반적으로 보호되지 않으며 스크래치에 취약하므로 2색 거울을 조심스럽게 처리해야합니다.현미경 회사를 공급하는 몇몇 필터 제조업체도 각종 판매 후 필터와 이색 거울을 제공하여 각종 형광 응용에 적용한다.블록 부분을 고정한 고정 부품 (핀 또는 작은 나사) 을 분리한 후 고정 클립을 풀거나 이동하여 거울을 제거한 다음 블록에서 조심스럽게 제거할 수 있습니다.간섭 코팅은 일반적으로 보호되지 않으며 스크래치에 취약하므로 2색 거울을 조심스럽게 처리해야합니다.현미경 회사를 공급하는 몇몇 필터 제조업체도 각종 판매 후 필터와 이색 거울을 제공하여 각종 형광 응용에 적용한다.블록 부분을 고정한 고정 부품 (핀 또는 작은 나사) 을 분리한 후 고정 클립을 풀거나 이동하여 거울을 제거한 다음 블록에서 조심스럽게 제거할 수 있습니다.간섭 코팅은 일반적으로 보호되지 않으며 스크래치에 취약하므로 2색 거울을 조심스럽게 처리해야합니다.현미경 회사를 공급하는 몇몇 필터 제조업체도 각종 판매 후 필터와 이색 거울을 제공하여 각종 형광 응용에 적용한다.

형광 필터 설계에는 긴 패스, 짧은 패스 (에지 필터), 좁은 밴드, 중간 밴드 및 광대역 밴드 필터 시리즈가 포함됩니다.그림 7에 표시된 스펙트럼은 몇 가지 일반적인 필터 아웃라인의 예를 보여줍니다.그림 7의 송신 필터 스펙트럼 (파란 곡선) 은 약 575 나노미터의 마감 파장을 가진 긴 간섭 필터에 의해 생성됩니다.긴 파장은 필터를 통해 전송되고 짧은 파장은 차단됩니다.같은 그룹의 좁은 대역 통과 자극 필터 (빨간색 곡선, 그림 7) 는 약 20nm 의 대역폭을 가지고 있지만, 2색 렌즈 (녹색 곡선) 는 중간 (455-490nm) 의 투과 영역과 광대역 통과 필터 (560)-775nm) 와 비슷하다.2색 렌즈는 녹색의 긴 패스 필터로 효과적으로 사용되기 때문에 가시 스펙트럼의 노란색과 빨간색 영역 (560~700nm) 을 필터 그룹에서 처리합니다.형광단의 흡수와 발사 스펙트럼 분포를 이용하여 적합한 형광현미경 필터 그룹을 선택하는 방법에 관한 작업 지식은 이 기술을 성공적으로 실시하는 데 *적이다.

2색 렌즈 (또는 빔 분리 렌즈) 는 형광 현미경 필터 조합에서 중요한 부품으로 장통 간섭형 필터와 유사하며 여러 층의 개전 재료를 가진 공차로 제조됩니다.2색 렌즈와 표준 간섭 필터 사이의 주요 차이점은 거울이 제한된 경계 파장에서 반사 및 투과하도록 특별히 설계되었으며 현미경과 발광기 광축에 비해 45도 각도로 조작되어야한다는 것입니다.2색 렌즈를 간섭 코팅이 자극 광원을 향하도록 배치하여 광학 시스템을 통해 90도 각도로 짧은 자극 파장을 샘플까지 반사할 수 있도록 합니다.같은 거울도 반드시 투과려과기로 되여 장파장형광발사를 물경에서 상평면으로 전달해야 한다.거의 전체 반사와 큰 투사 사이의 파장 변환 영역은 일반적으로 20 또는 30 나노미터로 제한되기 때문에 2 색 렌즈는 자극과 발사 파장을 정확하게 구분 할 수 있습니다.

특정 자극 파장대가 2색 렌즈의 반사 영역과 정확하게 일치하도록 형광 필터 그룹을 설계합니다.그 결과 자극광이 현미경을 통해 샘플에 효과적으로 반사되었다.샘플의 형광 발사는 이러한 파장이 검출기를 통과할 수 있도록 2색 거울의 높은 투과 영역과 일치해야합니다.장벽 필터는 전체 시나리오에서 그다지 중요하지 않지만, 여전히 산란과 반사의 자극 파장을 제거하고, 표적 이외의 탐침에서 오는 형광과 자발적인 형광으로 인한 일반적인 배경 강도를 확보하는 데 중요한 역할을 한다.필터 그룹을 생성하는 데 중요한 요소는 전송, 반사, 관련된 필터의 송신 곡선이 해당 영역의 송신 곡선과 일치하는지 확인하는 것입니다.그렇지 않으면 자극 파장이 2색 렌즈를 통해 이미지를 흐리게 할 수 있거나 형광 발사가 의도치 않게 거울에 반사되어 이미지의 밝기를 손상시킬 수 있습니다.

완벽하게 일치하는 것처럼 보이는 필터 조합에서도 각 필터의 스펙트럼 분포 사이에 약간의 중첩이 발생하여 성능이 저하될 수 있습니다.특히 주목할 만한 것은 자극 필터와 2색 렌즈 사이의 교란이다. 이로 인해 일부 자극 광선은 거울을 통해 필터 블록의 벽에서 반사될 수 있다.위에서 설명한 바와 같이 고경사 각도로 반사된 빛은 부분적으로 장벽 필터를 통해 이미지 명암비를 낮출 수 있습니다.필터를 통과하는 이러한 누출을 침투 또는 교차라고 하는데 실제로 모든 필터 조합이 많든 적든 발생한다.필터 제조업체와 현미경 회사가 주목하는 주요 분야 중 하나는 교차 수준을 낮추기 위해 형광 필터 조합의 설계를 개선하는 것입니다.

형광 필터 그룹의 몇 가지 구성은 그림 8과 같다.필터 블록 회전탑 (그림 8 (a) 에는 다섯 개의 블록이 포함되어 있으며, 필터 조합 사이에서 빠르게 변환할 수 있으며, 동시에 적어도 이 수의 형광 덩어리를 연구할 수 있다.회전탑 슬롯 중 하나는 일반적으로 투과광 관찰을 위해 가상 광학 블록으로 채워져 있거나 비어 있습니다.스핀들 이퀄라이저 (그림 8 (b) 를 사용하여 스핀들 이음매에 설치된 단일 간섭 필터를 포함하여 이중 또는 다중 태그의 샘플을 이미징하기 위해 자극 스펙트럼을 미세 조정합니다.회전 격려 평형기의 조절대는 필터의 대역 투과 영역을 더 짧은 파장으로 이동시킨다.따라서 이퀄라이저 필터가 수직 조명기 축에 수직인 0도 입사각에서 큰 회전 각도 45도로 회전할 때 필터의 대역 통과 영역은 25~50nm 사이의 값을 이동할 수 있습니다.자극 밸런서는 개별적으로 사용하거나 직렬적으로 사용하여 관찰된 형광 염료의 자극 대역폭을 변경하여 발사 강도를 동일하게 만들 수 있습니다.이 특징은 몇 가지 탐침이 함유된 샘플의 형광단 강도를 미세하게 조절할 수 있게 한다. 예를 들어 한 탐침에서 오는 형광 발사를 줄이는 동시에 다른 탐침의 강도를 증가시킨다.자극 밸런서는 개별적으로 사용하거나 직렬적으로 사용하여 관찰된 형광 염료의 자극 대역폭을 변경하여 발사 강도를 동일하게 만들 수 있습니다.이 특징은 몇 가지 탐침이 함유된 샘플의 형광단 강도를 미세하게 조절할 수 있게 한다. 예를 들어 한 탐침에서 오는 형광 발사를 줄이는 동시에 다른 탐침의 강도를 증가시킨다.자극 밸런서는 개별적으로 사용하거나 직렬적으로 사용하여 관찰된 형광 염료의 자극 대역폭을 변경하여 발사 강도를 동일하게 만들 수 있습니다.이 특징은 몇 가지 탐침이 함유된 샘플의 형광단 강도를 미세하게 조절할 수 있게 한다. 예를 들어 한 탐침에서 오는 형광 발사를 줄이는 동시에 다른 탐침의 강도를 증가시킨다.

박막 코팅 기술의 급속한 발전은 단일 간섭 필터에서 여러 개의 투사 피크를 생성하고 2색 거울에서 교차하는 반사 및 투사 밴드를 만드는 능력을 통해 증명 될 수 있습니다.적당히 일치할 때 두 개의 다파단 필터와 2색경을 조합하여 여러 개의 형광 필터 그룹을 생성할 수 있으며, 동시에 몇 개의 형광 덩어리의 발사를 자극하고 관찰할 수 있다.필터 그룹은 제조업체로부터 얻을 수 있으며 동일한 샘플의 두 개, 세 개 또는 네 개의 형광 덩어리에 적용됩니다.여러 필터 그룹의 주요 문제는 비용과 한 형광 프로브의 발사가 다른 대역 통과 영역을 통과할 때 발생하는 과도한 교차 또는 침투입니다.일부 샘플 (및 필터 그룹) 에서 침투는 배경 강도와 이미지 대비에 큰 영향을 미칩니다.많은 연구자들은 최적화된 필터 그룹을 사용하여 각 형광 덩어리를 각각 영상화한 다음 이미지를 복합체로 조합하는 경향이 있습니다.

첨단 형광 기술은 일반적으로 단일 2색 렌즈를 가진 여러 개의 자극 및 발사 필터를 사용해야합니다.이러한 연구를 용이하게하기 위해 많은 형광 현미경은 전동 필터 휠 또는 슬라이더를 갖추고 있으며 6 개의 개별 필터가 많이 포함되어 있습니다 (그림 8 (c 참조).슬라이더에 사용할 현미경을 설계하거나 수직 조명기에 슬라이더를 삽입하기 위한 특수 슬롯을 포함하거나 일반적으로 중성 밀도 필터가 포함된 슬라이더를 필터 슬라이더로 대체할 수 있습니다.일부 현미경 설계에서 수직 발광기는 발사 슬라이더를 수용하거나 발광기와 관찰관 사이에 설치된 보조 중간관도 슬라이더를 수용할 수 있다.직립 및 거꾸로 현미경에서 자극 필터를 포함하는 전기 필터 유닛은 일반적으로 중성 밀도 필터와 램프 상자 사이의 수직 조명기 광학 통로에 끼워져 있습니다.마찬가지로 전동 송신 필터 유닛은 수직 현미경 설계에서 수직 조명기와 고글 관찰관 사이에 배치되지만, 일반적으로 거꾸로 기기에 사용되는 검출기와 같은 외부 포트를 통해 연결된다.격려 및 발사 슬라이더와 전동 필터는 단일 2색 렌즈를 사용하는 이중 및 3중 격려 응용에 매우 유용하다.개별 샘플을 관찰할 때 필터 블록을 재배치해야 하는 필요성을 제거함으로써 연구자들은 이미지 간의 정확한 조준을 얻을 수 있습니다.

형광 현미경의 물경

모든 형태의 반사광 현미경 (형광 포함) 에서 이미지 강도는 물경 수치의 공경과 증폭률의 함수이다.실제로 강도 또는 밝기 (단위 면적 및 시간당 광자 통량으로 정의됨) 는 숫자 구멍 지름의 4 차원을 증가시키지만 증폭률의 제곱에만 반비례합니다.

강도 α(NA obj) 4 / M 2

여기서 NA는 대물렌즈 수치 공경과 M은 확대 배수이다.이 관계식에서 볼 수 있듯이 밝은 형광 이미지는수치 구멍 지름및 0.75 / 20x와 같은 낮은 확대율의 대물렌즈 집합.예를 들어, 수치 공경 1.4의 60x 계획 재소색차 유침물경은 이론적으로 같은 수치 공경의 100배 물경보다 더 밝은 이미지를 생성하지만 절충을 고려해야 한다.내부 렌즈 소자의 수를 늘리면 (고수치 공경 물경과 마찬가지로) 자발적인 형광과 내부 렌즈 표면에서 오는 강도가 감소하고 반사가 상응하게 증가한다.일반적으로 제조업체는 추천하는 형광 현미경 물경에서 대학 양인자와 증가하는 광선 투사 사이의 절충을 수행합니다.

일반적으로 고수치 구경유(1.3~1.4)와 물(1.2)은 계획 반딧불과 평면 복소색차 물경에 스며들어 거대한 집광 능력으로 인해 밝은 형광 이미지를 생성한다.이러한 물체거울은 우수한 색채 보정을 나타내기 때문에 다양한 형광 발사 파장을 같은 평면에 초점을 맞출 수 있다.재소색차와 반딧불 물경의 투광 특성은 약 350nm로 낮을 때 *이며, 이는 자외선 영역에서 자극되는 형광 염료(예: DAPI, Hoechst, Alexa Fluor-350 및 AMC)를 검사하기 위한 요구사항이다.내부 렌즈가 많지만 반사 방지 코팅이 된 저형광 유리로 제작되어 배경 형광을 최소화하고 매우 높은 명암비를 갖는 이미지를 생성합니다.

특수한 응용을 위해 설계된 물경은 형광 현미경에 널리 쓰인다.이런 종류에는 고수치 공경 수침, 여러 차례 침포 (기름, 물, 글리세린), 석영 렌즈 소자를 가진 자외선 물경이 포함된다.살아있는 세포 이미징 응용의 경우 두께(0.5-2mm) 배양 병벽을 통해 시료를 관찰할 수 있도록 보정 고리를 갖춘 긴 작업 거리 물경이 필요하다.매우 긴 초점 거리 (작동 거리) 를 가진 물경을 통해 두꺼운 시료 깊은 곳의 검사를 촉진하면 여러 제조업체에서 얻을 수 있으며 공기나 물을 통해 안경을 덮어 이미지를 만드는 데 사용됩니다.뚜껑 없는 유리 조각을 위해 설계된 긴 작동거리 침수물경도 테플론 전면 송곳이 있어 물경을 수용액에 담글 수 있다.20~30mm(약 5mm 물 포함)의 작동 거리에서 물속에 있는 자외선 자극(340nm)에 대해 비슷한 물거울을 생성한다.상대적으로 낮은 증폭 배율 연구의 경우 * 수치 공경(0.75~0.95)이 있는 20배 수침물경을 사용하는 것이 좋습니다.매우 비싸지만 이러한 물안경은 형광단 농도 및/또는 양자 생산율이 미미한 상황에서 매우 밝은 이미지를 생성합니다.

형광 현미경 부품

제조업체는 형광 현미경에서 증가하는 이미징 응용 프로그램의 사용 가능한 옵션을 늘리기 위해 기기에 유용한 추가 부품 단위를 지속적으로 생산합니다.예를 들어, 일부 현미경에서는 직사각형 필드 광맹 (그림 9 참조) 을 선택할 수 있는데, 이는 조사된 샘플 영역을 제한하여 명암비를 높이고 빛 표백을 줄일 수 있다.모듈식 현장 광맹은 수직 조명기의 전통적인 조리개 광맹 (또한 탈부착 가능한 모듈) 을 대체하여 디지털 영상 센서의 종횡비를 일치시키기 위해 설계되었다.직사각형 필드 정지는 콜러 조명의 효율을 높이고 전자 센서의 신호 소음비를 낮춘다.추가적인 이점으로 롤백 연구에서 프로그래밍 가능한 스캔 단계를 사용할 때 이미지 사각형 크기를 단계 단계와 일치하도록 조정할 수 있습니다.바늘구멍은 직사각형장 광맹과 유사하여 고도가 제한된 조명장이 필요한 응용에 사용할수 있다.

다른 부품에는 수은과 제논호 방전등과 같은 두 광원을 동시에 수직 조명기에 연결할 수 있는 듀얼 램프 케이스 어댑터가 포함됩니다.레이저 자극에 적용되는 조명기는 전체 내부 반사형광(TIRF), 형광 수명 이미징 현미경(FLIM) 등의 적용), 비율 이미징과 빛 표백 회복 실험에도 사용할 수 있다.또한 주요 제조업체가 제공하는 대부분의 연구용 형광 현미경은 각자의 레이저 스캐닝 공초점 부품에 쉽게 적응할 수 있습니다.직립식 현미경은 세 개의 관찰관을 통해 코크스 스캐닝 유닛을 받고, 후진 기기는 빔 스캐너를 현미경 프레임의 측면 또는 후면 포트에 연결할 수 있다.수직 조명기와 관찰관 사이의 이중 포트를 삽입하면 추가 광원을 도입하거나 형광을 한 개 이상의 검출기로 유도할 수 있습니다.대부분의 기기에는 C-마운트 어댑터 또는 표준 현미경 포트 액세서리 옵션이 있습니다.

전기 생리학 연구에 사용되는 형광 현미경을 설계하는 것은 이미 매우 복잡해졌다.많은 것이 전문적인 충격 흡수 레벨을 갖추고 있으며, 형광, 적외선 차분 간섭 대비 (IR-DIC) 의 실험과 전통적인 명장 대비 강화 영상 기술을 사용하기 위해 다양한 마이크로 조종기 부품을 받아들일 수 있다.동물경 회전판을 놓으면 물경의 신속한 무진동 교환을 실현하여 살아있는 세포와 조직을 영상화할 때 표본이나 기포의 침입을 방해하는 것을 방지할 수 있다.새로운 고수치 공경 장거리 작업 거리 2x와 4x 마이크로 렌즈 (물경) 를 사용하여 생물체에서 형광 거시적 관찰을 할 수 있는데, 이 렌즈들은 전문적인 필터 조합 블록을 갖추고 있다.또한 일부 제조업체는 입체 현미경의 액세서리로 형광 수직 조명기와 필터 세트를 제공합니다.

수직 조명기는 때때로 1.25배에서 1.5배의 증폭 계수를 옵션으로 선택할 수 있지만, 빈 증폭을 도입하는 고유한 문제 때문에 가능한 한 보조 렌즈를 사용하여 형광 이미지에 들어가는 것을 피해야 한다.몇 가지 모듈식 수직 조명기 설계에는 조명기 위에 여러 개의 카메라 포트가 포함된 빔 분리기 모듈을 연결하여 이미징 능력을 향상시키는 장치가 포함됩니다.현재 형광 현미경에 사용할 수있는 다양한 전기 액세서리를 고려할 때 연구원들은 물경 회전판, 스폿 렌즈, 필터 휠 및 플랫폼을 포함하여 이전보다 더 복잡한 이미징 기술을 얻을 수 있습니다.제조업체는 복잡한 형광 응용 프로그램의 많은 부품 설계에 많은 노력을 기울였는데, 이러한 응용 프로그램은 한때 다양한 출처의 * 부품으로 구축된 현미경만 사용할 수 있었다.형광 현미경이 세포 생물학이 됨에 따라 신경생리학과 임상 분야에서 점점 더 중요한 도구가 되고 있다

거꾸로 형광 현미경 설계

유사한 버전의 수직 형광 조명기는 현미경 브래킷을 거꾸로 (조직 배양) 하는 데 사용할 수 있습니다.역방향 스탠드는 또한 반사광 형광과 투과광 현미경의 다양한 명암비 향상 기술 간의 조합 또는 교체를 허용합니다.연구 수준의 역방향 현미경은 여러 개 (6 개 이상) 의 입력 / 출력 포트를 가지고 있으며, 일반적으로 프레임의 각 측면에 단일 포트가 있고, 후면의 하나 또는 두 포트 (위쪽 및 아래쪽) 와 하단 아래쪽의 하단 포트 현미경은 일부 모델에서 릴레이 렌즈를 사용하지 않고도 세 개 이상의 포트에서 마스터 이미지를 동시에 얻을 수 있습니다.이 연결 수준은 여러 광원, 필터 휠 및 카메라 시스템을 사용하여 복잡한 형광 분석을 수행 할 수 있습니다.거꾸로 현미경을 위한 수은과 제논 램프는 성능을 높이고 자외선과 적외선 스펙트럼 영역의 영상 차이를 줄이기 위해 표준 다중 소자 또는 비구면 집광렌즈와 함께 사용할 수 있다.또한 직립 현미경에 사용할 수 있는 액세서리와 유사하게 다양한 조명 어댑터를 사용하여 여러 조명 소스를 연결할 수 있습니다.

그림 10에는 Peltier 냉각 CCD 이미지 센서와 전통적인 35mm 필름 카메라 시스템을 갖춘 현대 거꾸로 (조직 배양) 형광 현미경의 단면 설명도가 나와 있습니다.필름에도 불구하고카메라의 용도는 제한적이지만 대부분의 역방향 현미경은 여전히 전면 베이스 아래쪽에 이러한 액세서리에 사용되는 포트를 포함합니다.그림 10에 표시된 현미경은 기둥에 장착된 텅스텐-할로겐 램프를 사용하여 전통적인 명장 투과 조명 (대비 향상이 있거나 없음) 을 수행할 수 있습니다.수은이나 제논호 방전등은 형광 현미경에 사용되며 특수 구성된 뒷포트에 연결된 반사광 조명기를 사용한다.공경과 장광맹, 그리고 중성밀도필터는 현미경 뒤쪽의 포트 부근에서 들어간다.일부 거꾸로 된 현미경 모델 (표시되지 않음) 에서는 액세서리를 첨부하기 위해 후면 보조 포트에 대한 액세스를 개선하기 위해 중간 분리막을 포함하는 L 반사 라이트 라이트를 사용할 수 있습니다.그림 10에서 현미경을 통과하는 광선은 노란색으로 투과광을 나타내고 보라색은 필터링되지 않은 호광등 조명을 나타내며 녹색은 필터링 형광 자극을 나타내고 빨간색은 형광 발사를 나타낸다.

현대 거꾸로 현미경 프레임은 직립 대응물처럼 컴퓨터가 설계하고 제조한 복합 재료로 구조와 열 안정성에 사용된다.또한 기계 플랫폼 부품 및 회로 구조 설계는 DIC 프리즘 삽입 또는 대물렌즈 보정 루프의 조정과 같은 일반적인 작업에서 대물렌즈 조향기를 조작할 때 푸시업 및 편향을 방지하기 위해 짧은 여정 거리와 높은 강성을 가지고 있습니다.선진적인 물경회전판대단계는 지연시간과 장시간의 형광관찰에서 실제로 초점표류를 제거할수 있다.표준 입식 현미경에 포함되지 않는 기타 스테이지 옵션에는 슬라이딩 및 360도 회전 스테이지, 유리 스테이지 삽입판, 가열판, 배양 접시 및 플레이트 브래킷 및 이산화탄소 배양 상자가 포함됩니다.

모듈식 설계를 갖춘 거꾸로 현미경은 전기생리학, 체외수정, 현미조작, 고해상도 DIC, 영상증강관찰 및 각종 선진형광기술의 연구에 쉽게 배치할수 있다.이들 기기는 공초점과 다광자 현미경에도 쉽게 적용될 수 있다.전동 부품에는 블라인드, 필터 휠, 회전 물체 렌즈 회전판, 형광 블록 회전판, 초점 드라이브와 집광경이 포함된다.높은 작업 거리, 침수, 자외선 자극 및 위상 대비의 고급 물경과 결합 할 때 모든 것이 고도의 광학 보정을 가지고 있으며 역치 현미경은 살아있는 세포와 조직 형광 연구를 수행하는 이상적인 기기입니다.

결론

형광 현미경에서 샘플 내 국부 형광단 농도 사이의 광범위한 변화와 한 형광 염료에서 다른 형광 염료로의 소광 계수와 양자 생산율의 차이는 정량에 대한 자극 강도에 대한 발사 신호에 현저한 영향을 미친다.많은 샘플이 특정 시야에 미량의 형광 재료만 포함하는 것을 고려할 때, 이러한 조합 인자가 생성하는 평균 형광 방출 수준은 자극 강도보다 4~6 단계 작습니다.이밖에 또 일부 더욱 복잡한 형광기술, 례를 들면 제자리교잡과 공진에너지전이 (FRET) 도 있는데 발사신호강도는 격발된 발사신호강도보다 9~10개 수량급이 작을수 있다.자극강도와 발사강도 사이의 이런 큰 차이를 보상하기 위하여 현대형광현미경은 반드시 형광신호를 교란하지 않고 자극조사를 10억차 이상 감쇠시킬수 있어야 한다.

형광현미경의 주요 특징 중 하나는 특징 파장에 대한 빛을 흡수하고 발사하는 형광탐지기의 높은 특이성으로 인해 이 기술은 복잡한 혼합물에서 매우 낮은 농도로 물경종을 선택적으로 검출할 수 있다.또한 형광의 높은 감도와 공간 해상도는 현미경의 광학 해상도 이하의 길이 척도에서 단일 분자를 정확하게 위치시키고 연구 할 수 있습니다.국부적인 환경 요소도 형광 발사에 심각한 영향을 미치기 때문에 이 방법은 pH, 점도, 이온 농도, 분자 거리와 취향, 막 전위, 소수성, 전하 분포와 확산 계수 파동의 이상적인 탐침이다.형광의 시간 해상도는 자극된 형광 프로브의 수명에 국한되며, 그것은 나노초급일 수 있다.많은 생물 과정이 이 시역에서 발생하기 때문에, 쇠퇴 동력학은 세포 과정에 관한 동적 정보를 밝혀낼 수 있다.전반적으로 이런 요소들은 형광현미술이 세포생물학에 응용되는 데 매우 중요하다.

지난 10 년 동안 형광 현미경은 놀라운 속도로 발전했으며 레이저 기술, 고체 탐지기, 필름 제조 간섭 및 컴퓨터 기반 이미지 분석 측면에서도 마찬가지로 빠르게 발전했습니다.고수치 공경 수침물경의 발전은 생물현상의 연구에 한층 더 도움이 되여 연구자들이 그 자연환경에서 활세포를 깊이있게 탐측할수 있도록 하였다.현미경 제조업체가 연구계의 변화하는 수요에 응답함에 따라 선진적인 형광 기기와 부품의 개발은 의심할 여지 없이 계속 발전할 것이며, 그들은 자연의 신비를 탐구하는 데 결국 심원한 의의를 가질 수 있다.