소개
단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 복잡한 세포와 조직 샘플에서 유전자 발현을 편차 없이 표상하는 기술이다.scRNA-seq chedi는 현대 생물학을 변화시켰지만 기술적으로 여전히 도전적이며 일반적으로 비용이 많이 듭니다.현재 시장에 나와 있는 솔루션은 수만 개의 세포의 초기 풀을 가지고 있을 때 일부 세포를 효과적으로 분석할 수 있다.그러나 희귀 세포군을 다루는 scRNA-seq 라이브러리의 간소화 방안은 여전히 부재하다.여기서 우리는 성가비가 높고 고도로 민감한 scRNA-seq를 위한 새로운 공판 검사법을 개발했다.이 워크플로우는 희귀 세포군의 희귀 샘플 라이브러리 제조를 지원합니다.이 새로운 워크플로우에서 (그림 1), 우리는 DispenCell 및 전용 검출 흡입 헤드 (SEED Biosciences, 스위스) 를 사용하여 전용 및 최적화 된 단세포 문고 제조 시스템 (MERCURIUS 고감도 BRB-seq 시약 상자,Alithea Genomics，스위스).
단세포 분배
우선 시퀀싱 라이브러리 제조에 앞서 DispenCell이 전용 분해 완충액에 단세포를 분배하는 능력을 테스트했다.림프세포계는 냉동된 작은 병에서 해동돼 두 번 대물림된 뒤 단세포 부유액에서 수확한다.10μm 세포필터(Miltenyi Biotec, 독일)로 세포를 걸러내고 RNAse가 없는 메틸셀룰로오스 분배용액(DispenMe, SEED Biosciences)에서 최종 농도 2×104 cells/mL로 계수하여 희석한다.그런 다음 DispenCell 센싱 헤드를 사용하여 세포 부유액에서 200 개의 세포를 적재합니다.DispenCell을 설정하여 단세포를 384공판으로 분배하고 공판은 4.2μL 분해완충액(HS BRB seq 시약함, Alithea Genomics)을 미리 설치한다.처음 96개의 구멍은 약 7분 동안 할당됩니다.그런 다음 다운스트림 분석을 위해 충분한 샘플이 있으므로 할당을 중지하십시오.
단세포 질량 제어
할당 즉시 SEED Biosciences에서 개발한 소프트웨어 DispenSoft를 사용하여 단세포 품질 제어 후 처리했습니다.대시보드의 각 구멍은 색상 코드의 행렬로 표시됩니다 (그림 2.a). 구멍에 단일 세포가 있으면 소프트웨어는 녹색으로 표시하고 빨간색 구멍에는 0 개 이상의 세포가 있으므로 버려야 합니다.파편과 세포를 구분하기 위해 크기에 기반한 직사각형을 문 제어하여 임계값을 설정합니다 (그림 2.b).역치보다 높은 봉우리만이 세포라고 할 수 있다.
여기서 우리는 77개의 단세포 구멍 (80% 단세포 분리율) 을 얻었다.DispenSoft를 사용하면 원시 임피던스 데이터를 기록 프로세스에도 사용할 수 있습니다.각 임피던스 커브를 수동으로 확인할 수 있습니다.단첨봉은 단세포의 특징 (그림 2.c) 이고 여러 세포가 여러 봉을 생성한다.이것은 DispenCell이 분해 완충액에 단순하고 빠르며 wanquan 추적 가능한 과정으로 단세포를 분배 할 수 있음을 나타냅니다.