[PCR 에 잡대 가 생기는 처리 방법]

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PCR (중합 효소 연쇄 반응) 과 겔 전기 수영은 분자 생물학 연구에서 일반적으로 사용되는 기술로, 일반적으로 PCR 증폭 산물을 감정하고 분석하기 위해 결합되어 사용됩니다.그러나 PCR 겔 전영을 할 때 종종 전영 스펙트럼에서 잡대가 발견되는데, 이러한 잡대는 실험 결과를 방해하고 심지어 실험에 실패할 수도 있다.

이 글은 PCR 겔 전기 수영 과정에서 잡대의 형성 원인을 탐구하고 가능한 해결 방안을 제공할 것이다.

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PCR 조건 최적화:PCR 반응 조건을 조정하면 퇴화 온도가 너무 낮으면 유인물과 템플릿의 비특이성 결합을 초래하여 비특이성 증폭을 유발할 수 있다;퇴화 온도가 너무 높으면 유인물과 템플릿의 정상적인 결합을 억제하여 효율 증대에 영향을 줄 수 있다.계단식 PCR 실험을 통해 최적의 퇴화 온도를 점차 확정할 수 있다. 일반적으로 PCR 반응의 퇴화 단계의 온도는 일반적으로 50 ° C에서 68 ° C 사이이며, 구체적으로 유인물의 염기 서열과 목표 DNA의 특성에 달려 있다.일부 유인물은 특정 지역의 특이성 결합을 보장하기 위해 더 높은 퇴화 온도가 필요하지만 일반적으로 최고 퇴화 온도는 68 ° C를 넘지 않습니다.

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잘못된 유인물 설계:유인물의 길이가 너무 짧거나 시퀀스가 중복되거나 높은 GC 영역이 포함되어 있으면 유인물과 템플릿의 비특이성이 결합되어 잡대가 생길 수 있습니다.유인물의 길이가 적당하고 서열이 중복되지 않으며 GC 함량이 적당한지 확인하고 유인물 내부나 유인물과 템플릿의 결합 구역에 높은 GC 구역이 나타나지 않도록 재설계해야 한다.

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잘못된 유인물:유인물의 사용량이 너무 크거나 특이성이 높지 않으면 비특이성이 증폭되어 잡대가 생길 수 있다.유인물을 바꾸거나 사용량을 줄이는 것이 좋습니다.

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템플릿 불순:템플릿 DNA에는 단백질, RNA 또는 기타 비표적 DNA 조각과 같은 불순물이 포함되어 있으며 PCR 증폭의 템플릿으로 사용되어 추가 스트라이프가 나타날 수 있습니다.

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템플릿 분해:템플릿 DNA는 추출이나 저장 과정에서 분해되며, 생성된 작은 조각 DNA는 비특이성 증폭의 템플릿이 될 수 있다.

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템플릿 DNA 순화:PCR 실험의 템플릿 DNA는 게놈 DNA (gDNA), 상호 보완 DNA (cDNA), 입자 DNA 등 다양한 출처에서 나올 수 있다.그러나 서로 다른 출처의 DNA는 구성과 복잡도에서 다를 수 있으며 이는 PCR 증가의 가장 좋은 시작량에 영향을 줄 수 있습니다.예를 들어, 50 µL의 PCR 반응에서 입자 DNA는 0.1-1 ng, gDNA는 5-50 ng이 필요합니다. 또한 사용된 DNA 중합 효소 유형은 최적의 템플릿 시작량에도 영향을 미칩니다.개조된 DNA 중합효소는 템플릿에 대한 친화력이 더 강하고 민감도가 더 높기 때문에 필요한 DNA 시작량이 상대적으로 적다.DNA 시작량을 최적화하는 것은 매우 중요하다. 시작량이 너무 높으면 비특이성 증폭의 위험이 증가할 수 있고, 시작량이 너무 낮으면 PCR의 득률을 낮출 수 있기 때문이다.때때로 PCR 실험 시나리오는 특히 gDNA의 경우 DNA 시작량을 표시하기 위해 복사 수를 사용합니다.복사수의 계산은 Avogadro 상수와 무어 질량과 관련되며, 구체적인 공식은 복사수 = L × 무어 수 = L × (총 질량/무어 질량) 이다.

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g² ⁺ 농도가 너무 높음:Mg²⁺는 PCR 반응에서 중요한 성분이지만 너무 높은 농도는 PCR 증폭의 특이성을 낮추고 비특이성 증폭의 위험을 증가시킨다.실험을 통해 최적의 Mg²⁺ 농도를 결정해야 합니다.

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효소의 용량 또는 품질 저하:효소의 사용량이 너무 높거나 효소의 질이 좋지 않으면 PCR 반응에 영향을 줄 수 있다.효소의 양을 낮추거나 다른 출처의 효소를 교체하는 것이 좋습니다.

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핫 부팅 PCR을 사용하려면:열가동 PCR은 저온도에서 반응할 때 발생할 수 있는 비특이성 증폭을 줄일 수 있다.

핫 스타트 PCR은 비특이성 증폭을 줄이기 위한 기술이다.일반적인 PCR에서는 반응 온도가 증폭 온도로 올라가기 전에 유인물이 템플릿 DNA에 결합되었을 수 있습니다.이로 인해 PCR 시작 단계에서 비특이성 증폭이 발생해 잡대나 가짜 양성 결과가 나올 수 있다.열 시동 PCR은 PCR 반응에 안정적인 DNA 중합 효소를 가열하여 이 문제를 해결합니다.

열가동 PCR의 관건은 고온 활성화가 필요한 중합효소를 사용하는 것이다.이러한 효소는 높은 온도에서 활성화되기 때문에 저온에서 비특이성 반응을 일으키지 않고 반응이 시작될 때 대상 DNA 서열을 증폭시키기 시작한다.

일반적으로 사용되는 일부 열 시동 중합 효소에는 열 활성 도메인을 가진 Taq DNA 중합 효소와 Pfu 또는 Phusion과 같은 고화질 중합 효소와 같은 열 안정성 Taq 중합 효소의 개량 버전이 포함됩니다.

그래서 현재의 효소는 기본적으로 모두 조건을 만족시킨다.

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랩 환경 확인:DNA 오염 및 실험 기기의 오염을 피하고 무균 기술과 처리된 시약을 사용하여 실험실을 청결하게 유지한다.

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계단식 최적화 PCR:온도 경도를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 특이성 증폭의 온도를 찾습니다.

베헝과학기술 지능 2차원 경도 PCR 기기동일한 반응에서 동시에 변성 및 퇴화를 최적화할 수 있는 온도 경도 변성은 가로 8행 변성 경도 세로 12열 퇴화 온도를 설정할 수 있어 최적의 퇴화 온도를 최적화하여 PCR 반응의 특이성과 효율을 높일 수 있다.

이 기술은 고품질 및 특이성 PCR 결과물을 보장하기 위해 유인물, 템플릿 및 PCR 조건을 최적화하는 데 매우 유용합니다.

이러한 방법은 개별적으로 또는 함께 사용할 수 있으므로 PCR 잡대 문제를 줄이거나 제거하는 데 도움이 됩니다.