형광정량PCR분석기는 형광신호변화를 실시간으로 감시하고 Ct값과 표준곡선분석을 결합하여 유전자의 정확한 정량을 실현하는데 그 핵심원리와 실현절차는 다음과 같다.

핵심 원리

PCR 증폭 반응 체계에 형광 기단(예를 들어 SYBRGreen 염료 또는 TaqMan 프로브)을 넣어 형광 신호 강도와 증폭 산물량을 동시에 변화시킨다.PCR 순환이 완료될 때마다 기기는 형광 신호를 수집하여 증폭 곡선을 생성합니다.형광 임계값 (일반적으로 베이스라인 신호의 10배 표준 차이) 을 설정하여 증폭 산물이 임계값에 도달했을 때의 순환 수 (Ct 값) 를 결정합니다.Ct 값은 시작 템플릿 양과 마이너스 관계가 있습니다. 즉, 시작 템플릿 양이 많을수록 Ct 값은 작아집니다.

구현 단계

표준 곡선 구축: 입자 DNA 순화 또는 체외 전사 RNA와 같은 알려진 농도의 표준품을 사용하여 경도 희석하고 다른 농도의 표준품을 모델로 PCR 증폭을 수행합니다.표준 품목 복사본의 대수는 가로, Ct 값은 누진으로 표준 커브를 그립니다.표준품 농도 범위가 10²-10¹ ⁰ 복제본 수일 경우 템플릿 농도와 Ct 값은 일반적으로 선형 관계(상계수 R²>0.99)가 양호하므로 이 범위에서 정확한 정량이 가능합니다.

미지의 샘플 검사: 미지의 샘플을 표준품과 동시에 증폭하고, 그 Ct 값에 따라 표준 곡선 공식에 대입하여 샘플의 대상 유전자의 복사 수를 계산한다.예를 들어, 표준 커브 공식이 y = 3.1372x+38.201(y는 Ct 값, x는 복사 대수)인 경우 샘플의 초기 템플릿 양을 역계산하여 얻을 수 있습니다.

내삼 유전자 보정 (상대정량): 서로 다른 샘플 간의 유전자 발현 차이를 비교할 필요가 있을 때 집사 유전자 (예: GAPDH, 베타-actin) 를 내삼으로 선택하여 목표 유전자와 내삼 유전자의 Ct 값 차이 (Ct) 를 계산하여 상대 발현량을 분석하여 샘플량 및 반응 효율 차이의 영향을 제거한다.