전자동 단백질 면역 자국 처리 시스템이 실험에서 나타날 수 있는 흔한 문제는 주로 신호가 약하거나 신호가 없으며, 배경이 높고, 다대 현상, 스트라이프 이상 등을 포함하며, 다음은 이러한 문제에 대한 상세한 분석이다.
신호가 약하거나 없음
1항과 2항은 일치하지 않는다. 2항은 1항숙주의 종과 같아야 한다. 례를 들면 1항은 쥐에서 왔고 2항은 항쥐항체여야 한다.
항체 농도 부족: 고농도 항체를 사용하고 4 ℃ 의 조건에서 부화 시간을 연장한다. 예를 들어 밤을 새워 부화한다.
폐쇄제와 항체의 교차 반응: 토온-20과 같은 온화한 오염물 제거제를 사용하거나 폐쇄제 (예: 탈지분유, BSA, 혈청, 젤라틴) 를 교체한다.
검사 대기 종을 식별하지 못하는 단백질: 설명서를 참조하여 면역원 서열과 단백질 서열을 비교하여 항체와 목적 단백질이 반응할 수 있도록 보장하고 양성 대조를 설정한다.
단백질 상량 부족: 각 레인 단백질 상량은 일반적으로 20μg을 초과하지 않으며, 단백질 효소 억제제를 사용하고 양성 대조를 설정한다.
회전막 불충분: 가역 염색약을 사용하여 회전막 효과를 검사하고, 회전막 조작이 정확한지 검사한다. 예를 들어 PVDF 막은 미리 메탄올에 담근 후 전이 완충액에 담가야 한다.
1 항 실효: 신선한 항체를 사용하여 재사용으로 인한 유효 농도 감소를 피합니다.
이항 피중질소나트륨 억제: 중질소나트륨과 HRP 표기 항체를 함께 사용하는 것을 피한다.
테스트 키트 만료 또는 섀시 비활성화: 신선한 섀시를 사용합니다.
배경 높이
특이성 폐쇄를 하지 않았거나 폐쇄가 충분하지 않다: 폐쇄 시간을 연장하고 적합한 폐쇄제를 교체하는 것을 고려한다.
1항 또는 2항 농도가 너무 높다: 항체를 적당한 농도로 희석하거나 더 높은 희석도 항체로 부화 시간을 연장한다.
이항과 폐쇄제의 비특이성 결합 또는 반응: 이항 대조를 설정합니다 (1항을 추가하지 않음).
미결합 단백질 세탁 불충분: 세탁 횟수 증가.
막 건조: 부화 과정 중 막이 마르는 것을 방지하고, 매 단계마다 막에 충분한 반응액이 있도록 보장해야 하며, 믹서에 넣어 끊임없이 휘저거나 가볍게 흔들어 막을 용액에 담글 수 있다.
부적절한 필름 선택: 질산섬유소막(NC막)은 PVDF막보다 배경이 낮아 실험 수요에 따라 적합한 필름을 선택할 수 있다.
다대현상
세포 전대 횟수가 너무 많고 단백질 표현이 다르다: 원시적으로 전대되지 않은 세포주를 사용하여 현재의 세포주와 함께 평행 대조 실험을 한다.
체내에 표현된 단백질견본은 여러가지 수식형식을 갖고있다. 례를 들면 아세틸화, 메틸화, 알킬화, 인산화, 당기화 등은 시약을 사용하여 견본을 인산화, 탈당기화하여 번역후의 수식을 증명할수 있다.
단백질 샘플 분해: 샘플 완충액에 단백질 효소 억제제를 충분히 첨가한다.
보도되지 않은 새로운 단백질이나 같은 단백질 가족 중 비슷한 표위를 가지고 구조가 다른 단백질이 검출되었다: 다른 문헌 보도를 열람하거나 BLAST를 사용하여 검색하고, 설명서가 추천하는 세포주 또는 조직을 사용한다.
일항 농도가 너무 높음: 항체 농도와/또는 부화 시간을 낮춘다.
스트라이프 예외
배경에 고르지 않은 흰색 반점이 있다: 막을 돌릴 때 막에 기포가 있거나 항체가 막에 고르게 분포되어 있지 않다. 막을 돌리는 과정에서 기포를 최대한 제거하고 항체가 부화할 때 흔들림을 유지해야 한다.
배경에는 검은 반점이 있다: 항체는 폐쇄제를 결합하여 폐쇄제를 여과할 수 있다.
깊은 배경에 흰색 스트라이프가 나타납니다. 1항 또는 2항이 너무 많이 첨가되어 항체의 농도를 희석시켜야 합니다.
목적 스트랩은 염색이 너무 낮거나 너무 높으며 분리가 철저하지 않다: 젤라틴의 비율을 바꾸고, 분자량이 많은 단백질은 저농도 젤라틴을 사용하며, 분자량이 적은 단백질은 고농도 젤라틴을 사용한다.
스트라이프 "미소" 효과: 마이그레이션이 너무 빠르거나 전기 수영 온도가 너무 높으면 pH 값과 마이그레이션 속도가 바뀌어 마이그레이션 속도나 저온 전기 수영 (예: 냉동 창고나 얼음 위에서 진행) 을 줄일 수 있습니다.
동일 단백질 교잡에 고르지 않은 스트라이프가 나타난다: 젤을 제조할 때 젤이 너무 빨리 응고되어 수영로에서 아크릴아미드의 비율이 고르지 못하므로 젤의 레시피를 참조하여 젤에 적당량의 TEMED를 첨가하고 방치할 때 젤의 상단에 적당량의 1% SDS (물희석) 를 첨가하여 젤이 마르지 않도록 할 수 있다.