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초유경
Beijing Chaoweijing Biotechnology Co., Ltd
오윤룡과제팀 광시야형광항법시스템 개발, 자유행위동물 고효률다광자영상 부여
날짜:2025-07-15읽기 :3
배경
단일 광자 (1P), 이중 광자 (2P) 및 3 광자 (3P) 현미경 기술을 포함한 형광 이미징 기술은 신경 과학의 발전을 크게 촉진했습니다.특히 미형화 형광 현미경의 출현은 자유 활동 동물 중 뉴런 구조와 활동 관찰의 새로운 패러다임을 열었다.단광자 자극의 고효율 덕분에 마이크로화 단광자 현미경 (m1PM) 은 LED 광원을 사용하여 수 밀리미터 범위의 조명과 그에 상응하는 영상 시야 (FOV) 를 실현할 수 있다.그러나 광학 절편 능력이 부족하기 때문에 m1PM의 체내 이미징의 해상도는 제한되어 있어 나무 돌기 등 정밀 구조를 관찰할 수 없다.쌍광자영상기술은 고유의 광학절편능력과 심층조직투과능력을 갖고있는데 그중 미형화쌍광자현미경 (m2PM) 은 이미 자유활동쥐의 대뇌에서 뉴런시냅스에 대한 영상을 실현했다.이 기술은 더욱 발전하여 영상 시야를 1 × 0.8mm2로 확대하여 동시 삼색 영상을 실현하였으며 854µm의 영상 깊이에 도달하였다.또한 미세화 삼광자 현미경 (m3PM) 은 삼광자 효과를 이용하여 영상의 깊이를 1mm 돌파한다.
마이크로화 다광자 현미경은 자유 활동 동물 영상에서 날로 중요한 역할을 하고 있지만 그 실천 응용은 여전히 많은 도전에 직면하고 있다.다광자현미경의 우수한 광학절편능력은 그 경심이 비교적 얕게 (3~20µm, 축방향해상도에 의해 확정됨.) 되며 영상시야는 일반적으로 1mm2 이내이다.안내가 부족한 상황에서 몇 밀리미터의 두개창이나 그라데이션 굴절률 렌즈 (GRIN Lens) 를 뛰어넘는 3차원 공간에서 목표 관심 영역 (ROI) 을 빠르게 포지셔닝하는 것은 여전히 도전적이다.특히 경험이 부족한 연구자의 경우 ROI를 확인하고 미세화 현미경을 쥐의 머리에 설치하는 데 수십 분, 심지어 몇 시간이 걸릴 수 있어 자유활동 동물 연구에서 이 기술의 추가 응용을 크게 제한했다.
이 문제를 해결하기 위해 개발팀은 초기 작업에서 광시야(WF) 물경과 m2P M헤드셋의 마이크로 물경(FHIRM-TPM)을 결합해 위치 추적을 위한 광시야 형광 영상 장치를 만들었다.그러나 초기 마이크로 사물 거울의 시야가 제한되어 있기 때문에 (약 150 µm) 몇 밀리미터 너비의 두개골 창문에서는 여전히 관심 지역을 빠르게 찾기 어렵습니다.또한 m2PM 이미지로 전환할 때 광시야 물경의 작업 거리가 제한되어 있기 때문에 (약 37.5mm) 광섬유를 비교적 크게 구부려야 하기 때문에 조작이 더욱 도전적이다.최근 Zong 등은 m2P M헤드셋을 고정하기 위해 회전대를 도입하여 각도 조정을 통해 특정 뇌 영역과 더 잘 맞춘다.이러한 진전에도 불구하고 3차원 뇌 조직에서 관심 지역을 빠르게 포지셔닝하는 것은 여전히 도전적이며 새로운 연구자들에게 가파른 학습 곡선을 가져왔다.또한 현재 m2/3PM의 작업 거리는 2mm보다 작기 때문에 z축 플랫폼을 사용하여 초점 평면을 포지셔닝할 때 샘플이나 물경은 손상되기 쉬우며 경험이 부족한 사용자에게 특히 뚜렷하다.전반적으로 향상된 안내 기능을 갖춘 다중 모드 이미징 플랫폼을 개발하고 자유 활동 동물에 대한 효율적인 이미징을 위해 표준화된 워크플로우를 구축해야합니다.
다중모드 형광 영상 플랫폼의 시스템 설계
이 문제를 해결하기 위해 개발팀은 다중모드형광영상플랫폼을 설계하여 광장형광항법시스템 (WF-Nav) 과 미형화쌍광자현미영상과 미형화삼광자현미상을 통합시켰다.WF-Nav 시스템은 단일 광자 자극의 장점을 최대한 발휘하기 위해 지정된 관심 영역을 빠르게 식별할 수 있는 큰 시야와 단일 세포 해상도 기능을 갖추고 있다.일단 목표 구역에 위치하면 시스템은 쌍광자 또는 삼광자 영상으로 원활하게 전환할 수 있으며, 더욱 높은 신호 잡음비 또는 심층 뉴런 영상을 실현할 수 있다.이어 m2PM이나 m3PM 프로브를 쥐의 머리에 고정하고 쥐를 풀어 자유롭게 움직이는 영상을 만들었다.
그림 1. 다중모드 형광 영상 시스템 설계
와이드 필드 형광 네비게이션 시스템 설계
WF-Nav 시스템은 다색 대시야 광시야 현미경과 다기능 어댑터로 구성되어 있습니다.이 시스템은 세 개의 LED를 자극 광원 (405nm, 473nm, 561nm) 으로 사용하고 높은 수치 공경의 비구면 집광 렌즈를 장착하여 LED 빔을 정직하게 하며 각 자극 광로에는 해당 필터 세트가 장착되어 있다.개발팀은 대시장 네비게이션을 실현하고 다광자 렌즈 그룹을 원활하게 전환할 수 있는 충분한 공간을 제공하기 위해 긴 작업 거리, 낮은 배율의 건식 물안경을 설계했다.이 물경 (3.3x) 은 반원거리 촬영 설계를 채택한다: 앞쪽은 두 개의 접착 듀얼 렌즈에 음광 초점도를 제공하고, 뒤쪽은 한 개의 구면 렌즈로 구성된다.이 구조는 주평면을 뒤로 이동하여 색차를 교정하여 수치공경을 유지하면서 초장유효초점거리의 작업거리를 실현하여 최종적으로 90mm의 작업거리의 돌파성지표를 달성하고 Φ5.64mm의 최대영상시각을 실현하였다.
그림2. 광장 형광 현미경 설계
이 팀은 와이드 모드와 다광자 이미징 모드 간의 원활한 전환을 위해 다기능 어댑터를 설계했다.이 어댑터는 광시야 물경을 연결하고 Z축 전동 플랫폼에서 초점 거리 조절을 한다.표준화된 m2/3PM 프로브 설계를 통해 프로브는 동일한 스탠드에 견고하게 장착할 수 있으며 다광자와 와이드 모드를 전환할 때 초점 이미지를 보장한다.
그림 3. 다기능 어댑터 및 초점 기능
90mm 작업 거리의 이 물경은 헤드, 광섬유 또는 탈부착 가능한 전동 줌 렌즈 모듈을 조작할 수 있는 충분한 공간을 제공한다.헤드 장착 브래킷은 슬라이딩 저항력이 극히 적은 (약 0.1N), 신축 거리가 12mm인 경량 직선 롤러 레일에 장착되어 있어 대물렌즈와 샘플의 충돌 위험을 효과적으로 피할 수 있다.헤드 장착 브래킷을 교체하면 mini2P 및 m3PM과 같은 다른 헤드 부품과 호환됩니다.또한 초소형화된 이중 광자 현미경의 크기와 축소 가능한 디자인 덕분에 일반 데스크탑 대물경에 비해 대부분의 방향에서 더 큰 관찰 각도를 제공하여 더 넓은 샘플 관찰 범위를 제공합니다.이 설계는 견본의 굵은 위치 효율을 현저하게 향상시켰다.
그림4. 서로 다른 물경과 미형화 쌍광자 현미경 관찰각의 대비
다음으로 개발자들은 광장형광현미경의 광학성능과 실제응용을 평가하였다.Thy1-YFPH 생쥐의 뇌 절편을 영상화하면 뉴런과 축돌기를 선명하게 식별할 수 있다.470nm 파장 아래 생체 칼슘 이온 영상, 561nm 파장 아래 형태학 영상으로 GCaMP6f 표기 뉴런 3천804개와 mCherry를 나타내는 생쥐 성형 콜라겐 세포 4천650개를 포획하는 데 성공했다.이러한 결과는 와이드 필드 현미경이 다색, 단세포 해상도 및 높은 트래픽 이미징 능력을 갖추고 있으며 관심 대상 영역 탐색에 뛰어난 성능을 제공한다는 것을 증명합니다.
영상5. 마이크로화 광장 현미경 고통량 영상
표준화 마이크로 다광자 현미경 영상 프로세스 구축
개발자들은 자유활동 생쥐의 m2PM 이미징 작업을 더욱 원활하게 하기 위해 표준화된 이미징 프로세스를 구축하여 자유활동 동물의 m2PM 이미징 효율을 높였다.먼저 두개창 이식 또는 GRIN Lens 이식과 같은 동물에 대한 바이러스 주사 및 외과 수술 작업을 수행한 후 2-4 주 동안 바이러스가 충분히 발현되고 수술 손상이 회복되도록 기다립니다.어떤 실험의 경우, 우리는 GCaMP6s와 mCherry를 초급 모션 피질 (M1) 뉴런에 표시한 후 생쥐를 WF-Nav 장치 아래의 러닝머신에 고정시켰다.이어 와이드필드 현미경을 통해 관심 지역을 표적으로 포착해 시야 중심에 조준한다.그 후 어댑터를 통해 m2PM 모드로 전환하여 920nm와 1030nm 파장에서 2색 2광자 이미징을 진행하고, 마지막으로 XY 축과 초점 평면을 정교하게 조정하여 몇 분 내에 최종 대상 영역을 확인할 수 있다.대부분의 경우 시멘트 수축으로 인한 초점 오프셋을 보상하기 위해 목표 초점 평면을 약 25 µm 높이고, Baseplate를 동물의 머리 부분의 헤드에 고정하여 약 10 분 동안 고착화 된 후 생쥐는 자유 활동 이미지를 만들 수 있습니다.
그림 6. 자유 활동 마이크로 이중 광자 현미경 영상 프로세스 표준화
개발자는 생쥐의 소셜 실험에서 뉴런의 칼슘 신호와 구조를 영상화하여 이 시스템을 검증하였는데, 전체 설치 조작 과정은 약 20분이 걸리고 성공률은 100% (n=15) 에 달하며, 경험이 없는 연구자도 쉽게 파악할 수 있어 실험 효율을 크게 향상시켰다.또 M1 구역 2층 뉴런과 성형교세포를 여러 날 반복해 영상화한 결과 베이스플레이트를 재장착하지 않고도 시야 조준이 안정적인 것으로 나타났다.
그림 7. 여러 날 동안 동일한 시야 이미지
표준화된 기계 설계 덕분에 m3PM 이미징 헤드는 스탠드에 쉽게 장착할 수 있습니다.다기능 어댑터를 적용하면 와이드 모드에서 3광자 이미징 모드로 원활하게 전환할 수 있습니다.광장 단광자 현미경 영상의 깊이에 한계가 있기 때문에 심층 신호는 종종 탐지하기 어렵다;얕은 표면혈관은 일정한 참고로 삼을수 있지만 표층을 보존한 비루스주사구역은 더욱 직접적인 형광표시를 제공하여 수직축에서 더욱 깊은 부위를 조준하는데 도움이 된다.개발자들은 GCaMP6f를 머리에 고정·발현한 생쥐에서 피질 표면에서 깊이 1020μm의 postsubiculum 구역 신경활동까지 기록하는 데 성공했고, 생쥐의 무단결석 행위 탐색 실험을 진행해 670μm 깊이에서 장시간 칼슘 신호 활동을 기록했다.
그림8. 미형화 삼광자 고정과 자유 행위 영상
이 사업은 북경정보과학기술대학 오윤룡교수 (통신저자), 북경대학 왕애민, 정평화교수 등이 완성했다.
[참고문헌]
Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. 자유롭게 행동하는 동물에서 효율적인 소형 다광자 이미징을 위한 광장 형광 탐색 시스템.신경광학. 2025;12(2):025018.도이: 10.1117/1.NPh.12.2.025018
초유경은 SUPERNOVA-100, SUPERNOVA-600, SUPERNOVA-3000, SUPERNOVA-SMART 등을 포함한 초소형화된 다광자 SUPERNOVA 전계 제품에 와이드 내비게이션 시스템을 적용할 예정이다.모든 초소형 다광자 현미경 사용자가 실제 이미징 과정에서 더욱 편리하고 안전하며 효율적인 조작 체험을 실현할 수 있도록 한다.